Рекомендуемая последовательность микробиологического исследования биоматериалов на вторичный аспергиллез бронхолегочной системы у больных туберкулезом включает [13, 15, 17]:
- прямую микроскопию образцов респираторного и хирургического (при добавлении хирургических материалов в схему лабораторного обследования) биоматериалов. Рекомендуемые методики прямой микроскопии для проведения рутинных микологических исследований в диагностических лабораториях противотуберкулезных организаций: мокрота (мазки готовят до гомогенизации пробы мокроты) – окраска по Граму, окраска по Романовскому–Гимзе (при необходимости), содержимое бронхов (мазки готовят из осадка после центрифугирования пробы) – окраска по Граму, окраска по Романовскому–Гимзе (при необходимости), плотный хирургический материал (биопсийный, резекционный) – препараты готовят в 10% растворе KOH с окраской калькофлюором белым или неокрашенными, жидкий хирургический материал (аспираты, экссудаты) (мазки готовят из осадка после центрифугирования) – нативные препараты, препараты с окраской по Граму (при необходимости);
- посевы образцов диагностических материалов на специальные питательные среды. Рекомендуемый набор питательных сред: агар Сабуро с хлорамфениколом (стандартная среда для посева респираторного и хирургического материалов), бульон Сабуро (среда обогащения для первичного выделения возбудителей аспергиллеза из хирургического материала), картофельно-декстрозный агар (дополнительная среда для посева хирургического материала при подозрении на аспергиллез, оптимальная среда для пересевов из среды обогащения для выделения возбудителей аспергиллеза из хирургического материала с последующей видовой идентификацией;
- культивирование посевов в термостате при оптимальном температурном режиме для выделения и дифференциации оппортунистических грибов. Рекомендуемый режим культивирования: мокрота, содержимое бронхов (посев проводят количественным методом, используя три чашки Петри: две чашки с дозированным объемом материала по 0,1 мл и контрольная чашка) – при 30°С (чашка с дозированным объемом материала и контрольная чашка) и 37°С (чашка с дозированным объемом материала) в обычной атмосфере, плотный и жидкий хирургический материал – при 30°С в обычной атмосфере;
- идентификацию выделенных из посевов клинических штаммов грибов рода Aspergillus до уровня вида. Видовую идентификацию плесневых грибов рода Aspergillus проводят с помощью специальных атласов-определителей [13, 21, 31], после обязательного субкультивирования штаммов на стандартных идентификационных средах (агар Чапека–Докса (стандартная справочная среда), картофельно-декстрозный агар) по совокупности микроморфологических признаков: 1) морфология бесполой стадии гриба (конидиеносцы, вздутия (шаровидные, полушаровидные, эллиптические, булавовидные или другой формы), конидиальные головки (колонковидные, рыхлоколонковидные или радиальные), конидиогенные структуры (одноярусные или двухъярусные), конидии), 2) морфология вегетативных структур (гифы вегетативного мицелия, покровные клетки (при образовании), склероции (при образовании), алейроспоры (при образовании)), 3) морфология половой стадии (телеоморфы), в случае образования in vitro (структуры полового спороношения (клейстотеции, сумки (аски)), аскоспоры; телеоморфы в культуре формируются у возбудителей A. glaucus (регулярно), A. nidulans (у части штаммов), Eurotium amstelodamii (=A. hollandicus) (регулярно)); макроморфологических признаков (характеристика колоний: цвет поверхности; структура, характер и зональность поверхности; наличие и окраска экссудата; наличие и окраска растворимого в среде пигмента; окраска обратной стороны колонии (реверзума); скорость и характер роста (по диаметру колонии в процессе роста), интенсивность спороношения); способности к росту in vitro при 37°С (важный дополнительный дифференцирующий признак). Микроскопическое исследование штаммов проводят сразу после начала споруляции (как правило, на 3 сутки исследования); культуру гриба на предметное стекло с каплей дистиллированной воды переносят с помощью микологического крючка и накрывают покровным стеклом; препараты исследуют при х400 и х1000 (при необходимости) увеличениях;
- тестирование чувствительности выделенных штаммов Aspergillus spp. к антифунгальным препаратам (триазольным антимикотикам (вориконазолу, итраконазолу, позаконазолу), амфотерицину В). Согласно данным по наличию вариативной активности антимикотиков, применяемых для терапии аспергиллеза, в отношении ряда возбудителей [14, 15, 31], выбор препарата для эффективной терапии аспергиллеза целесообразно проводить на основании результатов тестирования in vitro. По нашим данным, для возбудителей A. terreus (рис. 1), а также A. flavus (рис. 2), A. ochraceus характерна сниженная природная чувствительность к препарату амфотерицин В; для возбудителя A. ustus (рис. 3) – сниженная чувствительность ко всем триазольным препаратам. У части клинических штаммов A. ustus, A. nidulans была обнаружена перекрестная резистентность к двум или более антимикотикам группы азолов, что может существенно осложнять подбор препарата для лечения аспергиллеза, вызванного этими возбудителями [14, 15]. Для определения чувствительности клинических штаммов Aspergillus spp. с последующей интерпретацией значений минимальной подавляющей концентрации (МПК) препаратов следует использовать только стандартизованные тест-системы, рекомендованные для применения в клинических лабораториях для тестирования плесневых грибов [15, 46]. Мы рекомендуем использовать тест-систему «Sensititre» (колориметрический тест «YeastOne»), TREK Diagnostic Systems, соответствующую стандарту тестирования чувствительности плесневых грибов организации CLSI [14, 25]. Система включает препараты, обладающие активностью в отношении грибов рода Aspergillus, адаптирована для определения лекарственной чувствительности у возбудителей аспергиллеза (необходимое условие – способность выделенного штамма Aspergillus spp. к росту in vitro при 35°C) и позволяет использовать для оценки чувствительности грибов Aspergillus spp. к вориконазолу, итраконазолу, позаконазолу, амфотерицину В пограничные значения МПК, установленные организацией EUCAST (на основании соответствия методик тестирования и учета результатов). Для повышения достоверности получаемых результатов и безопасности проведения тестирования рекомендуем использовать модифицированную нами методику приготовлении споровой суспензии грибов Aspergillus spp. [14, 17].