Аллергены не входят в состав большинства наборов реагентов либо разнообразие и количество их в тест-системах невелико. Таким образом, существует необходимость дополнительного приобретения необходимых аллергенов. Некоторые исследователи применяют аллергены для кожных проб [75], аллергены, используемые для определения специфических IgE в сыворотке крови в анализаторах типа Immulite [99], или при ручной постановке в иммуноферментном анализе (АлкорБио) [100], готовят экстракты самостоятельно [42], а также используют готовые лекарственные препараты [101].
Сохраняются проблемы при использовании аллергенов в качестве стимуляторов активации базофилов:
- использование экстрактов натуральных аллергенов не всегда корректно (трудности стандартизации, возможные примеси неспецифически стимулирующих или ингибирующих агентов),
- применение коммерческих препаратов, выпускаемых для проведения кожных тестов, затруднительно ввиду того, что они могут содержать примеси цитотоксических и\или ингибирующих консервантов,
- стимуляция базофилов является дозозависимой, поэтому важно подобрать определенные концентрации аллергенов, достаточные для активации базофилов у сенсибилизированных пациентов, но не имеющие токсических эффектов, а также не вызывающие ложноположительных реакций у здоровых лиц,
- результат теста с использованием фармакологических препаратов в качестве индукторов трудно интерпретировать, т.к. часто реакцию в организме вызывает не сам препарат, а его метаболиты.
Необходимые характеристики аллергенов для теста активации базофилов - отсутствие цитотоксичности, обусловленной добавками, консервантами, неспецифической активации в результате присутствия эндотоксинов и лектинов, а также способность вызывать специфическую активацию клеток. В литературе высказывается мнение [94], что желательно использовать стандартизованные коммерческие аллергены, адаптированные для клеточных тестов. Их недостатком, на наш взгляд, является небольшой срок хранения после растворения лиофилизированной формы.
Помимо выбора источника аллергена, важной задачей является подбор оптимальной концентрации аллергенов в тесте активации базофилов. Сложно сопоставлять конкретные цифры в статьях разных авторов, тем более что производители тест-систем рекомендуют добавлять разное количество аллергена на образец крови. В наборе Allergenicity kit на 100мкл крови вносится 20мкл аллергена, в наборах Basotest и Flow CAST согласно инструкциям рекомендуется использовать равное количество крови и аллергена. Вносимое количество аллергена будет влиять на конечную концентрацию аллергена в пробе.
В литературе обычно указывается диапазон концентраций аллергенов. Например, для белковых аллергенов он находится в области мкг/мл-пкг/мл, для чего их разводят в 50-150 раз. Лекарственные аллергены активны в концентрациях мг/мл, их разводят 5-25-кратно [98]. Вероятно, что оптимальные концентрации аллергенов разных производителей могут значительно различаться в зависимости от способа их производства. Таким образом, подбор оптимальных концентраций ложится на плечи пользователей, что вносит некоторый субъективизм в оценку данного функционального теста. Многие производители реагентов рекомендуют использование нескольких концентраций аллергена для каждого пациента, что удорожает исследование.
В обзоре Woo-Jung Song и Yoon-Seok Chang [102] для большинства лекарственных препаратов (бета лактамы, фторхинолоны) указываются концентрации в мг/мл. Для жидких препаратов, например, рентгеноконтрастных веществ, рекомендуется разведение лекарственного средства 1:10 [103]. Ингаляционные аллергены, например D.pteronyssinus [104], а также аллергены Hymenoptera [105] авторы использовали в концентрациях нг/мл. Данный порядок концентраций рекомендован для применения в тесте активации базофилов компанией Buhlemann Laboratories AG, которая специализируется на выпуске этой продукции.
Согласно нашим данным [106] оптимальной концентрацией аллергенов производства АлкорБио (Россия) для использования в тесте активации базофилов является диапазон от 0,01 до 0,002 мг/мл, причем эти цифры схожи для пищевых (аллерген пшеницы) и ингаляционных (аллерген Aspergillus fumigatus) аллергенов у данного производителя.