3. КОНЦЕНТРАЦИЯ КОРТИЗОЛА И 6-Β-ГИДРОКСИКОРТИЗОЛА У СОТРУДНИКОВ ФПС ГПС МЧС РОССИИ

Определение концентрации кортизола и 6-β-гидроксикортизола в утренней порции мочи проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании со спектрофотометрическим детектированием с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа «1200» («Agilent Technologies», США) с диодно-матричным детектором (рис. 4).

Рис. 4. Высокоэффективный жидкостный хроматограф «1200» (Agilent Technologies, США) с диодно-матричным детектором.

Идентификацию кортизола и 6-β-гидроксикортизола осуществляли по времени удерживания и спектру, регистрируемому с помощью диодноматричного детектора в диапазоне длин волн 190-400 нм. Количественное определение проводили методом абсолютной градуировки.

Оборудование.

Высокоэффективный жидкостный хроматограф «1200» (Agilent Technologies, США) с диодно- матричным детектором.

Весы «Sartorius» (Германия) с измерением массы до 250 г. С точностью 0,0001-0,00001 г. или аналогичные.

Центрифуга «Allegra 25R» (BECKMAN COULTER, США) или аналогичная.

Шкаф лабораторный в комплекте «Koettermann» (Германия) 1800x900x2250.

Смеситель лабораторный Vortex V-3.

Реактивы и материалы.

Субстанция кортизола (99.8%, «Dr. Ehrenstorfer GmbH», сухое вещество).

Субстанция 6-β-гидрокортизола (98%, «Sigma-Aldrich», твердое вещество).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Кислота муравьиная фирмы Agilent, номер по каталогу G 2453-85060.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, 99,9%, «Biosolve Chimie», Франция.

трет-Бутилметиловый эфир, «Panreac», Испания.

Этилацетат, х.ч., Россия.

Средства измерения и вспомогательная посуда.

Колбы мерные вместимостью 10 и 100 мл, 1 класса точности, с погрешностью ±0,025 мл и ±0,1 мл соответственно по ГОСТ 1770.

Автоматические пипетки с объемом дозирования 0,5-5000 мкл (Biohit).

Виалы полипропиленовые вместимостью 250 мкл (Agilent).

Приготовление стандартных растворов 6-β-гидроксикортизола и кортизола.

Для приготовления стандартных растворов кортизола и 6-β-гидроксикортизола навески соответствующих субстанций (10,0 ± 0,1 мг) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и добавляли 50 мл ацетонитрила и 40 мл деионизованной воды. После полного растворения гормонов, содержимое колбы доводили до метки деионизованной водой.

Приготовление рабочих растворов кортизола и 6-β-гидроксикортизола

Рабочие растворы в диапазоне концентраций 2,5-100,00 мкг/мл готовили разбавлением стандартных опорных растворов в необходимое количество раз.

Приготовление калибровочных образцов кортизола и 6-β-гидроксикортизола.

В качестве бланкового образца мочи использовали физический раствор, содержащий 0,9% хлорида натрия. К каждой пробе объемом 500 мкл добавляли 5 мкл соответствующего рабочего раствора кортизола и 6-β-гидроксикортизола, затем 3000 мкл экстрагирующей смеси состава трет-бутилметиловый эфир: этилацетат (50/50, объемн.), встряхивали 15 минут с помощью перемешивающего устройства типа «Vortex», затем 10 минут центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Органический слой полностью переносили в чистую пробирку «Sarstedt» и высушивали при комнатной температуре в токе азота.

Сухой остаток растворяли в 75 мкл 50 % раствора ацетонитрила, после чего переносили в чистую виалу и анализировали. Градуировочный диапазон составляет 25-1000 нг/мл.

Подготовка хроматографа к выполнению измерений.

Настройка хроматографа проводилась в соответствии с руководством по эксплуатации. Хроматографическое разделение 6-β-гидроксикортизола и кортизола выполнялось с помощью колонки для обращено-фазовой хроматографии Zorbax Eclipse Plus C18 100 мм × 4.6 мм × 3.5 мкм с соответствующей предколонкой в градиентном режиме со скоростью элюирования 0,6 мл/мин. В качестве подвижной фазы А использовалась вода с 0,1% муравьиной кислоты, в качестве подвижной фазы В – ацетонитрил.

Подробно градиентный режим разделения кортизола и 6-β-гидроксикортизола представлен в таблице 3.

Таблица 3. Градиентный режим элюирования кортизола и 6-β-гидроксикортизола

Подготовка проб к измерениям.

Непосредственно перед проведением измерений пробы размораживали при комнатной температуре. К каждой пробе объемом 500 мкл добавляли 3000 мкл экстрагирующей смеси состава трет-бутилметиловый эфир: этилацетат (50/50, объемн.), перемешивали с помощью устройства типа «Vortex» в течение 15 минут, после чего центрифугировали 10 минут со скоростью 3000 об/мин. Весь органический слой переносили в чистую пробирку «Sarstedt» и высушивали при комнатной температуре в токе азота. Сухой остаток растворяли в 75 мкл 50% раствора ацетонитрила, после чего переносили в виалу и анализировали.

Выполнение измерений и обработка результатов измерений.

При выполнении измерений условия совпадали с условиями при проведении градуировики. Регистрировали хроматограммы при длине волны детектирования 242 нм. В условиях автоматической регистрации и обработки данных определяли в условных единицах площадь пиков аналитов. Их массовую концентрацию вычисляли по установленной ранее градуировочной зависимости. Типичная хроматограмма образца утренней мочи при определении кортизола и 6-β-гидроксикортизола представлены на Рис. 5.