2. ГЕНОДИАГНОСТИКА ПОЛИМОРФИЗМОВ CYP3A4 У СОТРУДНИКОВ ФПС ГПС МЧС РОССИИ

Для генотипирования брали кровь из локтевой вены в вакутейнер с ЭДТА. В пробирку типа «эппендорф» отбирали 100 мкл крови для последующего выделения ДНК. Пробы крови хранили при -40°С до момента выделения ДНК.

Генотипирование состояло из трех основных этапов – выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции с использованием соответствующих праймеров и анализ результатов. ПЦР проводили в режиме «реального времени» на термоциклере CFX96 (рис. 2.).

Рис. 2. Прибор для проведения ПЦР в режиме «реального времени» CFX96, BIORAD

Выделение ДНК проводили с использованием наборов фирмы «ДНКтехнологии» по прилагаемой методике:

В пробирку с подготовленным биоматериалом в объеме 100 мкл вносили по 600 мкл лизирующего раствора, затем 3-5 секунд встряхивали с помощью перемешивающего устройства типа «Vortex», после чего центрифугировали 1 минуту при 13000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость.

К полученному осадку добавляли 300 мкл реактива «Проба-Рапид», и встряхивали закрытые пробирки 5-10 секунд с помощью перемешивающего устройства типа «Vortex». Затем пробирки помещались на 10 минут в термостат, прогретый до 98 °C, после чего центрифугировались 3 мин. при 13000 об/мин.

Экстрагированную в надосадочной жидкости ДНК, использовали для выполнения ПЦР-амплификации. Допустимо хранение полученного материала ДНК в холодильнике (2-8°С) в течение семи суток, а также в морозильной камере при температуре порядка 20°С в течение одного месяца.

ПЦР и анализ результатов проводили с использованием тест-систем производства фирмы «Синтол»:

• «Набор реагентов для определения полиморфизма Phe189Ser гена CYP3А4 (rs 4987161);
• «Набор реагентов для определения полиморфизма A/G гена CYP3А4_3 (rs2740574).

Согласно методике размораживали реагенты, перемешивали их и центрифугировали. Приготавливали смесь для проведения реакции из расчета на 1 образец:

• 10 мкл 2.5Х Реакционной смеси,
• 10 мкл 2.5Х Разбавителя,
• 0,5 мкл Tag ДНК-полимеразы.

Реагенты перемешивали и центрифугировали. Вносили в ПЦР-пробирки по 20 мкл приготовленной смеси и по 5 мкл выделенной ДНК.

Параллельно с исследуемыми образцами ставили реакцию с прилагаемыми к тест-системе контрольными образцами (3 положительных контроля и один отрицательный контрольный образец) по сходной методике.

После добавления ДНК-пробирки центрифугировали, помещали в прибор и проводили реакцию в соответствие с протоколом (табл. 1).

Таблица 1. Протокол проведения реакции

Результаты реакции анализировали по пороговому циклу, учитывая результаты реакций положительных контрольных образцов.

Пример диалогового окна получения результатов генотипирования по одному из исследованных полиморфизмов представлен на Рис. 3.

Рис. 3. Диалоговое окно анализа результатов генотипирования по одному из исследованных полиморфизмов, выполненное в режиме «Дискриминация аллелей»