Глава 17. Применение хроматографических методов в биотехнологии

Хроматография — это комплекс физико-химических методов разделения и исследования веществ, находящихся в жидком или газо­образном состоянии, основанных на сорбционных способах их распределения между двумя несмешивающимися системами (подвижной и неподвижной).

В качестве неподвижной фазы используют твердое вещество — сор­бент или пленку жидкого вещества, нанесенную на твердый носитель. Подвижная фаза, как правило, представлена жидкостью или газом, ко­торые контактируют с адсорбентом.

Впервые метод хроматографии был разработан русским ученым М.С. Цветом в начале ХХ в. Он предложил использовать данный вид анализа для установления многокомпонентности смеси и ее количественного анализа с применением специальной аппаратуры, так называемой разделительной колонки.

В ходе хроматографического анализа происходит разделение смеси на составляющие ее компоненты и концентрирование их в слое адсорбента. Затем после применения строго специфичных растворителей (элюентов), снижающих силы адсорбции, происходит вытес­нение с током раствора индивидуальных веществ (рис. 17.1, см. цв. вклейку).

Классификация

Все хроматографические методы можно классифицировать следующим образом.

I. По агрегатному состоянию подвижной и неподвижной фаз:

1) газо-адсорбционная, или газо-твердофазная;

2) газо-жидко-твердофазная;

3) жидко-твердофазная;

4) жидко-жидкофазная;

5) флюидно-твердофазная;

6) флюидно-жидко-твердофазная.

II. По механизму разделения веществ: адсорбционная, распределительная, ионообменная, эксклюзионная, аффинная (биоспецифическая), осадочная.

Чаще на практике одновременно реализуется несколько механизмов разделения, например: адсорбционно-распределительная, адсорб­ционно-эксклюзионная и т.д.

III. По геометрии сорбционного слоя неподвижной фазы: колоночная и плоскослойная.

К плоскослойным методам относятся тонкослойная и бумажная хроматография, а к колоночным — капиллярная хроматография, в которой сорбент расположен на внутренних стенках колонки, а центральная часть колонки остается открытой для потока элюента (хроматография на открытых капиллярных колонках).

IV. По способу ввода пробы и способа перемещения хроматографических зон по слою сорбента: проявительная (или элюентная), фронтальная, вытеснительная.

Наиболее часто используют проявительный вариант хроматографии, в котором анализируемая смесь периодически импульсно вводится в поток подвижной фазы; при этом в колонке смесь разделяется на отдельные компоненты.

При применении фронтального варианта хроматографии иссле­дуемую смесь или подвижную фазу непрерывно подают в колонку. Фронтальная хроматография дает возможность получить в чистом ви­де только первый, наименее сорбируемый компонент, а последующие зоны содержат, как правило, по нескольку компонентов разделяемой смеси.

Вытеснительный вариант хроматографии предполагает введение в колонку после подачи анализируемой смеси специального вещества (вытеснителя), которое сорбируется лучше разделяемых компонентов, в результате чего образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ (рис. 17.2, см. цв. вклейку). Основным недостатком фронтального и вытеснительного вариантов хроматографии является необходимость регенерации колонки перед каждым последующим анализом.

Основы хроматографического процесса

Для проведения хроматографического анализа смеси веществ, их разделения или определения физико-химических свойств используют хроматографы. Основными узлами хроматографа являются колонка, детектор и устройство для ввода пробы. Функцию разделения анализируемой смеси на составные компоненты выполняет колонка. Детектор осуществляет функцию автоматического непрерывного определения концентрации разделяемых веществ в потоке подвижной фазы (рис. 17.3).

Рис. 17.3. Основной принцип хроматографического разделения: НФ — неподвижная фаза, покрывающая внутреннюю поверхность капиллярной трубки Т, через которую движется подвижная фаза (ПФ). Вещество А₁ имеет большее сродство к ПФ, а вещество А₂ — к НФ. А’₁ и A’₂ — положения зон тех же веществ через промежуток времени хроматографического разделения в направлении, указанном стрелкой

После введения с потоком подвижной фазы исследуемой смеси зоны всех веществ располагаются в начале хроматографической колонки. Затем компоненты смеси постепенно перемещаются с различной скоростью вдоль колонки. Скорости перемещения обратно пропорциональны коэффициентам распределения компонентов. Активно сорбируемые вещества имеют меньшую скорость передвижения. В процессе хроматографии идет непрерывная запись и регистрация величины сигнала детектора, который пропорционален концентрации анализируемого компонента. По завершении процесса получают хроматограмму, которая отражает расположение хроматографических зон, как на слое сорбента, так и в потоке подвижной фазы во времени.

Наиболее эффективным способом разделения белков из анали­зируемой смеси является колоночная хроматография с использованием в качестве носителей гидроксилапатита, производных целлюлозы и различных ионообменных смол.

Адсорбционная хроматография

Разделение смеси на отдельные компоненты основано на их сор­бируемости на твердом адсорбенте, в качестве которого, как правило, используют активированный уголь, гель фосфата кальция, оксиды кремния или алюминия. Адсорбент в виде суспензии в буферном растворе вносят в колонку и равномерно в ней упаковывают. Небольшой объем исследуемой смеси наносят на колонку, и отдельные компоненты адсорбируются на адсорбенте. После чего приступают к стадии десорбции компонентов из колонки путем введения специфичных элюентов. Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

Распределительная хроматография

В данном виде хроматографии основой для стационарной жид­кой фазы служит твердая фаза, в качестве которой применяют ­крахмал или силикагель. Перед нанесением на колонку образец растворяется в подхо­дящем органическом растворителе. Разделяемые компоненты подвергаются многократному распределению между неподвижным водным слоем и движущейся фазой органического растворителя, при этом они с различной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные коллектором фракции пробы, содер­жащие один компонент, соединяют и затем выделяют его в чистом виде.