Глава 6. Инженерная энзимология

Инженерная энзимология — это одно из направлений в биотехнологии, которое основано на использовании ферментов (или ферментных систем), в изолированном виде или в структуре живых клеток, в качестве катализаторов с целью получения определенных целевых продуктов. Внедрение в производство таких биотехнологических продуктов, как ферменты, резко повысило его возможности и качество. Однако существует проблема нестабильности ферментов; изолированные ферменты быстро теряют активность из-за незащищенности системами клеточного гомеостаза организма, в который они внедрены. Проблема нестабильности решена путем создания так называемых «промышленных биокатализаторов» — иммобилизованных ферментов. В данном случае под иммобилизацией подразумевают связывание фермента с нерастворимым носителем при сохранении каталитической­ активности фермента.

Иммобилизованные ферменты обладают рядом преимуществ:

• являясь гетерогенными катализаторами, с легкостью отделяются от реакционной среды, могут использоваться неоднократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса;
• процесс иммобилизации ведет к изменению свойств фермента, что позволяет регулировать субстратную специфичность, устойчивость, зависимость активности от условий среды;
• иммобилизованные ферменты долговечны и во много раз стабильнее свободных энзимов.

Все перечисленные свойства обеспечивают высокую эффективность, экономичность и конкурентоспособность технологий, которые используют иммобилизованные ферменты.

Носители для иммобилизации ферментов

Материалы, используемые в процессе иммобилизации ферментов, должны обладать следующими характеристиками: высокой биологической и химической стойкостью, нерастворимостью, гидрофильностью, про­ницаемостью для ферментов и коферментов, субстратов и продуктов реакции, быстрой активацией носителя (переход в реакционно-способную форму).

Носители для процесса иммобилизации ферментов делятся на органические и неорганические (рис. 6.1).

Рис. 6.1. Классификация носителей для иммобилизации ферментов

Органические полимерные носители. Все органические полимерные носители, которые существуют на данный момент, можно разделить на синтетические и природные. Следует отметить, что синтетические и природные носители дополнительно подразделяют в зависимости от их строения.

Среди природных полимеров выделяют липидные, белковые и полисахаридные носители, а среди синтетических — полиамидные, полиметиленовые и полиэфирные. Природные носители обладают рядом преимуществ, а именно полифункциональностью, доступностью и гидрофильностью, но наряду с этим имеют и недостатки — био­деградируемость и высокую стоимость.

Из полисахаридов в процессе иммобилизации часто используют декстран, целлюлозу, агарозу и их производные. Для придания устойчивости химической структуре линейные цепи декстрана и целлюлозы поперечно сшивают эпихлоргидрином. Сетчатые структуры, полученные путем сшивания, используют для введения различных ионогенных группировок. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (глутаровый альдегид, формальдегид, глиоксаль) синтезирован новый носитель — губчатый крахмал, который обладает высокой устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей в процессе иммобилизации применяют хитин, накапливающийся в значи­тельных количествах в виде отходов в результате промышленной пе­реработки представителей ракообразных (креветки, крабы). Хитин обладает химической стойкостью и имеет ярко выраженную пористую структуру.

В качестве носителей практическое применение среди белков нашли структурные протеины: кератин, коллаген, желатин (продукт переработки коллагена). Перечисленные белки широко распространены в природе, что объясняет их доступность в значительных количествах, дешевизну и наличие большого числа функциональных групп для связывания фермента. Следует отметить способность белков к биодеградации, что необходимо при конструировании иммобилизованных ферментов в медицинских целях. К недостаткам белков как носителей относят их высокую иммуногенность.

Наряду с природными носителями в инженерной энзимологии широко используются синтетические полимерные носители благодаря их многообразию и доступности. К синтетическим носителям относятся полимеры на основе стирола, поливинилового спирта, акриловой кислоты; полиуретановые и полиамидные полимеры. Многие синтетические полимерные носители механически прочны, но при образовании обладают способностью обеспечивать варьирование в широких пределах величины пор и тем самым дают возможность поступления различным функциональным группам. Часть синтетических полимеров может быть произведена в различных формах: гранулы, волокна, трубы. Все перечисленные свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.

Носители неорганической природы. В качестве неорганических носителей чаще всего применяют материалы из глины, стекла, керамики, силикагеля, графитовой сажи; кроме этого, могут использоваться силохромы и оксиды металлов. Особенностью неорганических носителей является то, что они могут быть подвержены химической модификации, с этой целью они покрываются пленкой оксидов алюминия, циркония, титана или обрабатываются органическими полимерами. Следует отметить, что основным преимуществом неорганических носителей является легкость регенерации; кроме этого, подобно синтетическим полимерам, они могут быть произведены в любой форме и получить их можно с разной степенью пористости.

Таким образом, к настоящему моменту создано значительное количество разных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каждого индивидуального энзима, который используется в определенном технологическом процессе, должны подбираться приемлемые варианты как носителя, так и способов и условий иммобили­зации.

Методы иммобилизации ферментов

Методы иммобилизации ферментов разделяют на две группы: физические методы — без образования ковалентных связей между энзимом и носителем; и химические методы иммобилизации — с возникновением ковалентной связи между ними (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Методы иммобилизации ферментов: Ф — молекула фермента

Реализация физических методов иммобилизации ферментов осуществляется посредством адсорбции энзима на нерастворимом носителе путем включения его в поры поперечно-сшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы.

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При адсорбционной иммобилизации молекула белка удерживается на поверхности носителя за счет гидрофобных, электростатических, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Для определения эффективности адсорбции белковой молекулы на носителе необходимо учитывать удельную поверхность (плотность центров сорбции) и пористость носителя. Следует отметить, что процесс адсорбции ферментов на носителях, относящихся к нерастворимым, крайне прост и достигается при контакте водного раствора энзима с носителем. При таком варианте иммобилизации активность фермента сохраняется практически на уровне 100%.