Глава 3. Совершенствование биообъектов

Основная цель биотехнологического процесса — получение в масштабных количествах высокоэффективного конечного продукта, что становится возможным лишь при оптимизации методических подходов, а также в условиях применения биообъектов с совершенными свойствами продуцента или биокатализатора.

Изменение биообъекта, направленное на улучшение его характеристик и благоприятное для его использования в производстве, называется совершенствованием. Совершенствование биообъекта — это получение продуцентов с мутациями в геноме, которые отличаются от исходного биообъекта в сторону улучшения биотехнологических свойств, в частности, в сторону увеличения образования целевого продукта.

Цели, которые преследуют при совершенствовании продуцента:

• увеличение продуктивности в достижении большего выхода лекарственных веществ на единицу биомассы;
• придание продуценту способности использовать менее дефицитные и более дешевые среды;
• отсутствие возможности развития реакции ретроингибирования при биосинтезе конечного продукта;
• устойчивость продуцента к бактериофагам;
• нетребовательность к оборудованию, то есть биосинтез не должен снижаться при несовременной технологии оборудования;
• оптимизация свойств продуцента в аспекте медицинской промышленности (продуцент не должен иметь неприятного запаха и т.д.).

Выделяют несколько направлений совершенствования биообъектов: мутагенез, селекцию, клеточную и генную инженерию.

Мутация

Для биотехнологического процесса важны мутации, меняющие наследственность эмбриональных клеток, так как именно они будут унаследованы следующим поколением. В результате мутаций происходит изменение первичной структуры ДНК в конкретном ее участке, что в конечном счете приводит к изменению фенотипа биообъекта. Важным с позиций биотехнологии является изменение биосинтетической способности биообъекта.

Мутации могут быть реализованы как на уровне репликона (изменение числа и порядка расположения генов), так и внутри индивидуального гена. Могут встречаться так называемые спонтанные мутации, обнаруживаемые в популяции клеток без специального воздействия на нее (рис. 3.1).

Рис. 3.1. Классификация мутаций по уровням организации

Различают цитоплазматические (внехромосомные) и ядерные (хромосомные) мутации. Типы мутаций: дупликация (удвоение) или амплификация (умножение) структурных генов; делеция («выпадение» участка хромосомы); транспозиция (перенос участка хромосомы в новое место) или инверсия (поворот участка в хромосоме на 180°); «точечные» мутации [изменения происходят в пределах одного гена: трансверсия (замена пурина на пиримидин) и транзиция (замена одного пурина на другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин)] (рис. 3.2).

Рис. 3.2. Основные типы мутаций

Способствуют повышению активности биообъекта, образующего целевой продукт, мутации, которые приводят к следующим результатам:

• увеличению количества структурных генов, включенных в систему синтеза целевого продукта;
• «выключению» репрессорных генов, регулирующих синтез целевого продукта;
• нарушению системы ретроингибирования;
• изменению системы транспорта предшественников целевого продукта в клетку;
• подавлению «суицидного» эффекта.

С целью получения мутаций биообъекты обрабатывают физическими (ультрафиолетовые, ã-лучи, рентгеновские лучи) или химическими (нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители и др.) мутагенами. Механизм активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК, прежде всего на азотистые основания ДНК без летального исхода.

После обработки биообъекта мутагенами формируются фенотипические изменения наследственного характера, после чего проводят отбор и оценку нужных биотехнологу мутаций. Для их выявления обработанную культуру высеивают на твердые питательные среды разных составов, изучают рост колоний; каждую колонию пересеивают и полученную культуру проверяют по тем или иным признакам по сравне­нию с исходной; затем отбирают «+-варианты», отдавая предпочтение прежде всего мутантам с пониженной способностью к реверсии, то есть со стабильно измененным «выгодным» признаком.

Проводя замену состава питательных сред, можно определить особенности метаболизма клеток колонии по сравнению с клетками исходной культуры. В этом направлении интересен «метод отпечатков», состоящий из следующих стадий:

• разводят популяции микробных клеток так, чтобы на чашке Петри с питательной средой вырастало около ста колоний, с четким разделением;
• конструируют модель «стерильного бархатного дна», для чего на металлический цилиндр, соответствующий диаметру чашки Пет­ри, надевают бархат, затем стерилизуют;
• далее прикладывают «бархатное дно» к поверхности питательной среды в чашке с выросшими на ней колониями, и колонии «отпечатываются» на бархате;
• затем бархат с отпечатанными колониями прикладывают к поверхности сред разного состава.

Таким образом можно установить, клетки какой колонии в результате мутации приобрели, например, устойчивость к антибиотику и т.п.

Производственные штаммы с высокой продуктивностью нестабильны и требуют постоянного контроля при хранении и постоянной проверке на продуктивность.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия заключается в индуцированном обмене участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. В результате могут быть созданы продуценты новых веществ или организмы с ценными для биотехнолога свойствами. Результатом применения методов клеточной инженерии может быть получение межвидовых и межродовых гибридов биообъектов.

Этапы клеточной инженерии:

• удаление у микроорганизмов клеточной стенки для получения протопластов;
• слияние (фузия) протопластов с образованием диплоидов;
• инкубация диплоидов для получения разных вариантов комбинаций кольцевых хромосомных нитей;
• высевание суспензии протопластов на твердую питательную среду;­
• изучение и отбор культур, приобретающих новые качества, представляющие интерес для биотехнолога.