Приложение 2. Методы окраски и приготовления препаратов для микроскопии грибов

Гидроксид калия-диметилсульфоксид

Для прямого микроскопического исследования соскобов кожи, волос и ногтей на наличие грибковых элементов. Дает более быстрое просветление препарата, чем KOH.

• (CH₃)₂SO₄ смешать с дистиллированной водой объемом 60 мл.
• Добавить 10 г KOH.
• Размешать.

Калькофлуор белый с 10% раствором калия гидроксида

Для прямого микроскопического исследования грибковых элементов в соскобах кожи, волос, ногтей и других клинических образцов.

Калькофлуор белый (M2R, Blankophor B) — флюоресцирующий краситель, используют для отбеливания в целлюлозно-бумажной промышленности. Избирательно связывается с целлюлозой и хитином клетки грибов. Краситель флюоресцирует под ультрафиолетовым светом. Метод требует наличия флюоресцентного микроскопа.

Метод.

• Приготовление гидроксида калия: растворить 10 г KOH в 90 мл дистиллированной воды, добавить 10 мл глицерина.
• Приготовление калькофлуора белого: растворить 0,1 г порошка калькофлуора белого в 100 мл дистиллированной воды при слабом нагревании.

Микроскопия.

• Смешать одну каплю каждого раствора по центру предметного стекла.
• Поместить образец в раствор и накрыть покровным стеклом.
• Осторожно нагреть препарат и исследовать под микроскопом в ультрафиолетовых лучах на наличие грибковых элементов, которые флюоресцируют ярко-зеленым или голубовато-белым цветом — в зависимости от применяемых фильтров.

Лактофенол хлопковый синий

Для окрашивания и микроскопической идентификации грибов.

• Лактофенол хлопковый синий — 0,05 г.
• Кристаллы фенола (C₆H₅OН).
• Глицерин — 40 мл.
• Молочная кислота (CH₃CHOH COOH) — 20 мл.
• Дистиллированная вода — 20 мл.

Краситель получают в течение 2 дней. В 1-й день растворить лактофенол хлопковый синий в дистиллированной воде. Оставить на ночь. На 2-й день добавить кристаллы фенола и молочной кислоты, размешать до полного растворения. Добавить глицерин. Хранить при комнатной температуре.

Окраска по Боголепову

Для четкого окрашивания актиномицетов, нокардий, плесневых грибов.

• На фиксированный мазок налить свежеприготовленный водный раствор эозина на 2–3 мин (5 мл насыщенного спиртового раствора эозина, 95 мл дистиллированной воды).
• Слить краску, не споласкивая в воде, просушить фильтровальной бумагой.
• Окрасить карболовым генциановым фиолетовым (через фильтровальную бумагу) в течение 5 мин. Раствор готовят из расчета 5 капель насыщенного спиртового раствора краски на 1 мл 2,5% водного раствора карболовой кислоты. Краска после суточного стояния годна не более 6 сут.
• Залить йод + [калия йодид + глицерол] (Люголя раствор с глицерином^♠) на 2–3 мин.
• Обсушить фильтровальной бумагой.
• Дифференцировать 96% раствором этанола (Этилового спирта^♠), наливая и сливая его, пока не отойдет синяя краска и не обесцветится мазок (20–60 с).
• Хорошо промыть в проточной воде, высушить фильтровальной бумагой.

Результаты: грибы, актиномицеты, нокардии окрашиваются в темно-синий цвет. Культуры грибов должны быть свежими (их гибель ухудшает качество окрашивания).

Окраска по методу Гомори–ГрокоттА

Для обнаружения грибковых элементов в срезах тканей: грибы коричневого или черного цвета, фон бледно-желтый или бесцветный. Окружающие ткани —светло-зеленые.

Фиксация: 10% раствор формальдегида (Формалина^♠).

• Депарафинировать срезы.
• Обработать 5% раствором хромовой кислоты в течение 1 ч.
• Промыть в проточной воде в течение 10–30 с.
• Промыть 1% раствором бисульфита натрия в течение 1 мин.
• Промыть в проточной воде в течение 5 мин.
• Промыть в 3 порциях дистиллированной воды по 2 мин в каждой.
• Поместить в раствор метенамина серебра (5 мл 5% раствора нитрата серебра + 100 мл 3% раствора метенамина) на 30–60 мин при температуре 56–60 °С до приобретения желтовато-коричневой окраски. Окраску контролировать под микроскопом.
• Промыть в 6 порциях дистиллированной воды.
• Тонировать в 0,1% растворе хлорного золота в течение 2–5 мин.
• Промыть в дистиллированной воде.
• Закрепить в 2% растворе натрия тиосульфата в течение 2–5 мин.
• Промыть в проточной воде.
• Докрасить в рабочем растворе светлого зеленого в течение 30–45 с.
• Дегидратировать и заключить в бальзам.

Приготовление метенамина серебра: 5 мл 5% раствора азотнокислого серебра смешивают с 3% раствором метенамина (Уротропина^♠). Сначала образуется белый осадок, который исчезает при помешивании. Раствор становится прозрачным и бесцветным. Может сохраняться в течение 2 нед при комнатной температуре и 1 мес в холодильнике.

Приготовление 3% раствора метенамина: 3 г гексаметилентетрамина + 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление основного раствора светового зеленого: световой зеленый Lightgreen 0,2 мл + дистиллированная вода 100 мл + ледяная уксусная кислота 0,2 мл.