Лабораторная диагностика помогает быстро установить и/или подтвердить причину (этиологию) ОРИ и назначить специфическую этиотропную терапию в случае обнаружения у больного вирусов гриппа, а также используется при проведении мониторинга циркуляции возбудителей гриппа и ОРИ в целях эпидемиологического надзора [1].
С помощью лабораторной диагностики уже за сутки до появления симптомов инфекции вирусы гриппа можно обнаружить в инфицированных клетках организма человека.
Существует несколько подходов в лабораторной диагностике гриппа [2]: прямые методы, позволяющие выявить вирусы [культуральные, реакции гемагглютинации (РГА), РТГА, гемадсорбция, микронейтрализация], антигены [в том числе иммунохимические — иммунохроматографический анализ (ИХА), метод флуоресцирующих антител (МФА)] и обнаруживающие фрагменты генома вируса (молекулярно-генетические методы); непрямые методы, выявляющие специфические антитела к вирусам гриппа (ИХА, РТГА, реакции связывания комплемента, микронейтрализация, иммуноферментный анализ).
Культуральные методы позволяют получать (изолировать) из образцов биологического материала инфицированных людей жизнеспособные вирусы гриппа и проводить их идентификацию в РГА и РТГА.
Изоляция вирусов гриппа в чувствительных системах является важным методом, доступным в вирусологических лабораториях и референс-центрах, необходимым в эпидемиологических исследованиях для оценки антигенных характеристик циркулирующих и новых вирусов гриппа и оценки фенотипической устойчивости к противовирусным препаратам. Вирусная культура также является единственным способом производства вакцин.
Получение вирусной культуры стало возможным после того, как F.M. Bernet (1936) и T. Francis и соавт. (1937) выявили чувствительность хорионаллантоисной оболочки развивающихся куриных эмбрионов к вирусам гриппа. Куриные эмбрионы имели ряд преимуществ перед лабораторными животными, в частности, высокую чувствительность, стерильность, экономичность (не требуют дополнительного ухода и кормления) и легкую доступность (наличие птицефабрик и инкубаторов). Принцип метода заключается во введении в аллантоисную/амниотическую полости 9–11-дневных развивающихся куриных эмбрионов 0,2/0,1 мл клинического материала от пациентов с признаками гриппозной инфекции (носоглоточные смывы, аспираты, бронхоальвеолярный лаваж, аутопсийный материал) с последующим инкубированием в течении 48–72 ч при 36/34 °C (грипп А/грипп В, соответственно). Наличие жизнеспособного вируса гриппа определяют постановкой РГА (см. ниже), которую проводят с аллантоисной/амниотической жидкостью зараженного куриного эмбриона. Отрицательным считается образец, не проявивший гемагглютинирующей активности после трех «слепых» пассажей.
Систему развивающихся куриных эмбрионов применяли для выделения эпидемических штаммов вирусов гриппа достаточно длительный период (вплоть до середины 1990-х годов), когда стало очевидным снижение тропизма современных штаммов вируса гриппа человека (но не птиц и свиней) к клеткам, выстилающим аллантоисную полость, с переходом на чувствительные культуры клеток. Куриные эмбрионы продолжают использовать как чувствительную систему для получения вакцинных штаммов, высокоиммунных специфических сывороток и производства гриппозных вакцин как у нас в стране, так и за рубежом [3].
В начале 1990-х годов для изоляции эпидемических штаммов вируса гриппа экспертами ВОЗ были рекомендованы две перевиваемые линии культур клеток — MDCK и Vero. В 1958 г. S.Ch. Madin и N.B. Darby выделили MDCK (Madin–Darby Canine Kidney cells — клетки почек собак Мадин–Дарби) из почечных канальцев взрослой собаки породы кокер-спаниель. В 1962 г. Y. Yasumura и M. Kawakita в университете г. Тиба получили линию культур клеток Vero из эпителия почки, взятой у африканской зеленой мартышки. Отличие клеточных культур от куриных эмбрионов заключается в спектре рецепторов специфического связывания гемагглютинина вируса гриппа: HA в процессе инфицирования клеток-мишеней связывается с клеточными рецепторами двух видов (α2,3-Gal и α2,6-Gal), различающихся между собой по положению гликозидной связи между сиаловой кислотой и терминальной галактозой. В куриных эмбрионах клетки аллантоисной полости представлены большим количеством рецепторов с α2,3-Gal, амниона — с α2,6-Gal. В то же время MDCK и Vero содержат рецепторы с большим содержанием α2,6-Gal, более близкие спектру эпителиальных клеток, выстилающих верхние дыхательные пути человека [4]. Наибольшее практическое применение в вирусологических лабораториях, занимающихся надзором за циркуляцией вирусов гриппа, как у нас в стране, так и за рубежом, получила культура ткани MDCK. В то же время обе культуры применяют для производства гриппозных вакцин.
В последнее время в связи со снижением тропности эпидемических штаммов вируса гриппа, особенно A (H3N2), к клеткам MDCK культура была модифицирована дополнительным обогащением рецепторами вида α2,6-Gal и снижением числа рецепторов вида α2,3-Gal, что еще больше приблизило ее к структуре клеток эпителия верхних дыхательных путей человека (MDCK-SIAT1) [4].
Принцип изоляции штаммов вируса гриппа заключается в заражении сформированного монослоя клеток культуры ткани MDCK/MDCK-SIAT1 образцами клинического материала (носоглоточные смывы, аспираты, бронхоальвеолярный лаваж, аутопсийный материал), полученными от пациентов с симптомами гриппозной инфекции. Инфицированную культуру инкубируют при 34–37 °C при визуальном контроле появления цитопатического действия (ЦПД), которое при наличии вируса развивается в течение 48–72 ч с полным разрушением монослоя в виде «облака» свободно плавающих клеток; при отсутствии ЦПД культуру выдерживают до 7 сут. Отрицательным считается образец, не проявивший развитие ЦПД после трех «слепых» пассажей (с подтверждением в РГА).
При развитии ЦПД отбирают пробы культуральной жидкости для постановки РГА, для чего проводят ее двукратные разведения (титрование) с последующим добавлением равного объема взвеси эритроцитов.