4. Методы определения лекарственной устойчивости ВИЧ-1

Существует два основных подхода определения ЛУ ВИЧ-1: фенотипический и генотипический [1–3].

При использовании фенотипического метода на первом этапе проводят амплификацию интересующих генов исследуемого вируса. Затем, используя полученные фрагменты ДНК и плазмиду, содержащую хорошо охарактеризованный геном ВИЧ без интересующих генов, создается новый вариант вируса. В результате таких манипуляций исследователи получают рекомбинантный вирус, часть генома которого содержит гены ВИЧ, ЛУ которого необходимо определить, а часть — вируса с известными характеристиками. Затем полученный вирус размножают на культурах клеток в присутствии АРВ-препаратов в различных концентрациях. Через определенное время проводят оценку эффективности репликации вируса, определяя таким образом концентрацию АРВ-препаратов, подавляющую размножение рекомбинантного варианта ВИЧ на 50%.

Фенотипический метод считается «золотым стандартом» при проведении исследований ЛУ ВИЧ. Кроме того, он позволяет оценить степень резистентности в количественном выражении. Однако этот подход чрезвычайно дорог, длителен и требует высокой квалификации специалистов. Поэтому в рутинной лабораторной практике он используется крайне редко [2]. Фенотипический метод применяют на этапах разработки АРВ-препаратов, в частности для оценки профиля ЛУ, а также в сложных случаях у пациентов с широким спектром резистентности [4]. В России фенотипические тест-системы не зарегистрированы и практически не применяются.

Генотипический подход основан на секвенировании определенных участков генома ВИЧ с последующим анализом полученных нуклеотидных последовательностей на предмет наличия в них мутаций. Исследуемая последовательность сравнивается с референсной ­последовательностью «дикого» варианта вируса, который чувствителен ко всем АРВ препаратам.

Изменения в нуклеотидной последовательности иногда приводят к изменению аминокислотной последовательности, а это изменяет строение и функции белков. В свою очередь, изменения работы белков могут становиться причиной возникновения устойчивости вируса к АРВ-препаратам.

Генотипический подход определения ЛУ ВИЧ осуществляют с помощью классического секвенирования методом Сэнгера. На протяжении более 15 лет он широко использовался как в научных исследованиях, так и в рутинной практике. Однако его недостатком является низкая пропускная способность. Кроме того, классическое секвенирование имеет низкую чувствительность выявления минорных вариантов вируса, а именно таких вариантов, которые встречаются в организме менее чем у 20% вирусной популяции. В целом ряде исследований было показано, что минорные резистентные варианты ВИЧ могут иметь клиническое значение, повышая риск вирусологического неуспеха [2, 5–8].

Относительно недавно для секвенирования ВИЧ начали применять более современные методы, которые называются секвенированием следующего поколения (next generation sequencing). Такие методы более производительны, чем классическое секвенирование. Поэтому у лаборатории появляется возможность без значительного увеличения времени и трудоемкости анализа проводить исследование не отдельных вирусных генов, а всего вирусного генома и секвенировать большое количество клинических образцов одновременно. Кроме того, чувствительность next generation sequencing значительно выше и позволяет выявлять минорные варианты вируса, вплоть до 1% общей вирусной популяции [9], что улучшает точность анализа и в ряде случаев имеет клиническую значимость.

После завершения процесса секвенирования полученная нуклеотидная последовательность вируса анализируется с целью выявления мутаций ЛУ. Поскольку количество возможных мутаций, делающих вирус резистентным, велико, для оценки уровня прогностической устойчивости ВИЧ-1 к АРВ-препаратам используются различные базы данных, позволяющие с помощью автоматических алгоритмов провести такой анализ быстро и безошибочно.

В последнее время появились «быстрые» тесты для оценки ЛУ ВИЧ [10]. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) указывает на возможность использования таких тестов в развивающихся странах, поскольку их стоимость, продолжительность анализа и требования к квалификации персонала значительно ниже по сравнению с вышеописанными тестами [11]. Принцип работы «быстрых» тестов частично схож с традиционными генотипическими исследованиями. На первом этапе проводится экстракция РНК вируса из клинического материала, затем осуществляется амплификация некоторых фрагментов генома вируса. Далее вместо длительной и трудоемкой процедуры секвенирования в случае использования «быстрого» теста проводится выявление ограниченного количества наиболее частых мутаций ЛУ с помощью гибридизации. В настоящее время эти тесты позволяют определять ЛУ ВИЧ к ряду препаратов классов НИОТ, ННИОТ и ИП. Нужно отметить, что поскольку в процессе исследования с помощью «быстрых» тестов нуклеотидная последовательность генома вируса не определяется, то их результаты непригодны для молекулярно-эпидемиологических исследований [4].

Литература

1. Бобкова М.Р. Лекарственная устойчивость ВИЧ. М.: Человек, 2014. 288 с.
2. Hoffmann С., Rockstroh J. HIV 2015/16. https://hivbook.files.wordpress.com/2016/04/hiv-2015-16-complete.pdf
3. Федеральные клинические рекомендации 2017. Анализ лекарственной устойчивости ВИЧ. Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины» https://fedlab.ru/upload/medialibrary/f38/_-_10_04_2017_.pdf
4. Clutter D.S., Jordan M.R., Bertagnolio S., Shafer R.W. HIV-1 drug resistance and resistance testing // Infect. Genet.Evol. 2016. Vol. 46. P. 292–307. doi: 10.1016/j.meegid.2016.08.031
5. Johnson J.A., Li J.F., Wei X. et al. Minority HIV-1 drug resistance mutations are present in antiretroviral treatment-naïve populations and associate with reduced treatment efficacy // PLoS Med. 2008. Vol. 5. Issue 7. P. e158. doi: 10.1371/journal.pmed.0050158
6. Li J.Z., Paredes R., Ribaudo H.J. et al. Low-frequency HIV-1 drug resistance mutations and risk of NNRTI-based antiretroviral treatment failure: a systematic review and pooled analysis // JAMA. 2011. Vol. 305. Issue 13. P. 1327–1335. doi: 10.1001/jama.2011.375
7. Li J.Z., Kuritzkes D.R. Clinical implications of HIV-1 minority variants // Clin. Infect. Dis. 2013. Vol. 56. Issue 11. P. 1667–1674. doi: 10.1093/cid/cit125
8. Metzner K.J., Giulieri S.G., Knoepfel S.A. et al. Minority quasispecies of drug-resistant HIV-1 that lead to early therapy failure in treatment-naive and -adherent patients // Clin. Infect. Dis. 2009. Vol. 48. Issue 2. P. 239–247. doi: 10.1086/595703
9. Кириченко А.А., Свиридова А.А., Лопатухин А.Э. и др. Корреляция результатов высокопроизводительного и классического методов секвенирования при анализе лекарственной устойчивости вируса иммунодефицита человека у пациентов на фоне неэффективной антиретровирусной терапии // Инфекционные болезни. 2019. Т. 17. № 2. С. 12–19. DOI: 10.20953/1729-9225-2019-2-12-19
10. Natoli M.E., Rohrman B.A., De Santiago C. et al. Paper-based detection of ­HIV-1 drug resistance using isothermal amplification and an oligonucleotide ligation assay // Anal. Biochem. 2018. Vol. 544. P. 64–71. doi: 10.1016/j.ab.2017.12.008
11. Rhee S.Y., Jordan M.R., Raizes E. et al. HIV-1 Drug Resistance Mutations: Potential Applications for Point-of-Care Genotypic Resistance Testing // PLoS One. 2015. Vol. 10. Issue 12. P. e0145772. doi: 10.1371/journal.pone.0145772