Глава 1. Методы и маркёры

Арсенал методов гистологии, эмбриологии и цитологии включает разнообразные (наряду с классической гистологической техникой) методы исследования структуры и функции клетки, применяемые в молекулярной и клеточной биологии. В этой главе дан краткий обзор методов и маркёров, применяемых для идентификации различных типов клеток.

Гистологическая техника

Основные типы материала для микроскопии — гистологические срезы (например, печени, лёгких), мазки (например, крови, красного костного мозга), смывы. Мазки подразделяют на мазки-отпечатки (например, слизистой оболочки щеки для определения полового хроматина), ПАП-мазки (в гинекологической практике). В любом случае материал для исследования сначала фиксируют, затем последовательно обезвоживают, заливают в твёрдые среды, готовят срезы и производят окраску.

Фиксация

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания.

Фиксирующая жидкость

Быстрое проникновение химического фиксатора в живую ткань — условие сохранности структур in situ. Наиболее распространённые фиксаторы — формалин, спирты, глутаральдегид. Небольшие кусочки ткани фиксируют, помещая их в раствор фиксатора. Целые органы перед выделением перфузируют, т.е. прокачивают фиксатор через сосудистую систему органа.

Криофиксация

Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (–196 °C).

Лиофилизация

Материал как для световой, так и для электронной микроскопии подвергают быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Последующее высушивание в вакууме вызывает возгонку льда. Метод позволяет исключить обработку ткани в промежуточных средах (обезвоживание и заливка).

Обезвоживание

Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в неё сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующих смесей (большинство фиксаторов — водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды — обезвоживание в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости.

Заливка

Заливка — необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает её раздавливание и сминание при резании, даёт возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространённая среда для заливки — парафин, также используют целлоидин, пластические среды и смолы.

Приготовление срезов

Микротом

Серийные и отдельные срезы различной толщины и площади для световой микроскопии готовят с помощью специального устройства — микротома (рис. 1-1). Различают санные и ротационные микротомы с ручной и электромеханической системой подачи ножа. Стальной нож микротома позволяет получить срезы толщиной 0,5–100 мкм из залитых в парафин, целлоидин или полиэтиленгликоль кусочков ткани. Приготовленные для последующей световой микроскопии срезы монтируют на предметное стекло.

Рис. 1-1. Ротационный микротом. Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования (Alberts B. et al., 1989)

Криостат

Если фиксация приводит к инактивации предполагаемых для изучения молекул (например, ферментов, биогенных аминов), используют микротом-криостат, позволяющий получить для световой микроскопии срезы толщиной 0,5–500 мкм из замороженной ткани в термически изолированной камере с низкой (до –35 °C) и регулируемой температурой. Криостаты широко применяются в приготовлении срезов для экстренной диагностики новообразований у больных в момент удаления опухоли. В криостатах последнего поколения предусмотрены независимая система охлаждения ткани и ножа, а также ручная или автоматическая система подачи образца.

Ультратом

Ультратом (ультрамикротом) — автоматизированный прибор, позволяющий получать срезы из материала, залитого в смолу. С помощью стеклянных или алмазных ножей готовят ультратонкие срезы толщиной от 0,08–0,1 мкм (для электронной микроскопии) до 0,5 мкм (полутонкие срезы для световой микроскопии).

Вибротом

Микротом с вибрирующим лезвием для получения тонких срезов фиксированных и нефиксированных тканей без замораживания называется вибротомом. Современные вибротомы имеют моторизованный режущий ход. Частота вибрации лезвия от 0 до 100 Гц позволяет получать срезы толщиной от 0,1 до 1500 мкм.

Замораживание-скалывание

Метод криосколов (замораживание-скалывание) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем электронном микроскопе.

Мазки и смывы

Готовят для микроскопии высушиванием на предметном стекле либо кратковременной фиксацией.

Интерпретация гистологических срезов

К одним из наиболее сложных и трудоёмких навыков в гистологии относится умение интерпретировать получаемые на тех или иных срезах двухмерные (2D) изображения и создание на их основе представлений о трёхмерной (3D) структуре изучаемого объекта. Полную картину может дать суммирование и сопоставление многих (последовательных, или серийных) срезов объекта.

Определённые трудности возникают при распознавании по отдельным срезам изображения структур со сложной формой (полых, изогнутых, извитых, переплетённых и пр.) (рис. 1-2).

Рис. 1-2. Соотношения между реальными трёхмерными структурами и их срезами, дающими двухмерные изображения. На рисунке показаны различные сечения изогнутой трубчатой структуры (например, кишки). Стрелки указывают, как отдельные элементы трёхмерного (3D) объекта представлены в двухмерном (2D) изображении на гистологическом препарате (Junqueira L.C., Carneiro J., 1991)