Глава 5 Флуоресцентно-микроскопические методы оценки функционального состояния и выживаемости нейронов

А.М. Сурин¹, Л.Р. Горбачева², С.М. Струкова², В.Г. Пинелис³, Т.П. Сторожевых³

5.1. РЕГИСТРАЦИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СВОБОДНЫХ ИОНОВ Са , Nа и Н

5.1.1. Измерения концентрации свободных ионов

Са²+ ([Ca²]_i)

Изменения концентрации ионов Са²+ в клетке отражаются на динамике, по-видимому, всех внутриклеточных процессов, включая биохимические реакции, структурные перестройки, функционирование и подвижность органелл, регуляцию генома, а также межклеточные взаимодействия [14, 15, 22, 25, 61, 66, 69, 70]. С нарушений кальциевого гомеостаза зачастую начинаются нарушения функционирования всей клетки. Пути предотвращения нарушений Са²+-гомеостаза и поиск способов его нормализации после того, как дизрегуляция произошла, являются одним из лидирующих направлений предупреждения гибели клеток [36, 59, 80]. После того как было установлено, что митохондрии не только в изолированном состоянии, но и внутри клетки способны поглощать огромные (в масштабах клетки) количества Са²+, интерес к регуляторной и патогенной роли Са²+ в клетках возрос еще больше [22, 73]. Это особенно актуально для нейронов, поскольку данный тип клеток содержит в плазматической мембране и синаптических окончаниях большое число разнообразных потенциал- и лигандуправляемых Са²+ каналов [4]. При нарушениях в центральной нервной системе происходит избыточная стимуляция глутаматных рецепторов, влекущая за собой

¹ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (125315, Москва).

² Кафедра физиологии человека и животных Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (119991, Москва).

Научный центр здоровья детей РАМН (119991, Москва).

Рис. 5.1. Структуры флуоресцентных Са²+-индикаторов Fura-2, Fluo-3 и Rhod, а также их спектры возбуждения флуоресценции (сдвинутые влево кривые на графиках) и спектры испускания флуоресценции (сдвинутые вправо кривые на графиках). Для Fura-2 показана химическая структура собственно индикаторной формы, тогда как для Fluo-3 и Rhod показаны структуры их ацетоксиметиловых эфиров. Из представленных индикаторов только Fura-2 является двухволновым, поэтому на графике спектры Fura-2 представлены двумя парами кривых: А - спектры Са²+-связанной формы; В - спектры в безкальциевом буфере. Для индикаторов семейства Rhod показаны также заместители (R₅, R₆) и места их локализации, позволяющие изменять константу диссоциации комплексов с Са²+ без изменения их флуоресцентных спектров (см. также цветную вклейку)