Глава 4 Измерение внутриклеточной концентрации кальция при помощи флуоресцентных индикаторов

А. Дворжак^1,2, О. Мяхар^1,2, С.И. Кирищук²

ВВЕДЕНИЕ

В организме человека содержится несколько килограммов кальция, однако большая его часть находится в связанном состоянии (например, в костях). Концентрация же ионов кальция (Ca²+) внутри клетки (по сравнению с другими ионами) поддерживается на очень низком уровне. Поскольку кальций является вторичным посредником, то не только небольшое изменение внутриклеточной концентрации Са²+ ([Са²+]), но также кинетика и/или пространственная (не)однородность этого изменения определяют последовательность реакций, протекающих в клетке. Именно поэтому ученые всегда стремились разработать метод, позволяющий точно измерить флуктуации [Са²+].

Первой попыткой были кальцийселективные электроды. Суть метода заключалась в том, что кончик электрода покрывали специальной мембраной, которая была проницаема для Са²+, но непроницаема для других ионов [4]. И хотя этот метод и позволил получить первичные данные о [Са²+] [9, 11], он имеет ряд ограничений:

• кальцийселективные электроды сложно изготовить;

• введение электрода в клетку часто сопряжено либо с повреждением кальцийселективной мембраны, либо с повреждением самой клетки;

• [Са²+] может быть измерена только в одной точке;

• точность измерения [Са²+] в субмикромолярном диапазоне, т.е. нефизиологических величин, невысока.

¹ Кафедра фундаментальной и прикладной физиологии, Российский государственный медицинский университет (117997, Россия, Москва, ул. Островитянова, 1).

² Institute of Neurophysiology, Johannes-Mueller-Center of Physiology, Charite-UniversityMedicine Berlin (Tucholskystr., 2, 10117, Berlin, Germany).

Применение биолюминесцентных белков позволило сделать еще один шаг вперед. Связывание иона Са²+ белком экворином (aequorin) приводит к излучению фотона (так называемая люминесценция), который можно зарегистрировать, например, при помощи фотоумножителя. Этот метод позволил измерить [Са²+] в аксоне кальмара [1, 3], но он не решил основной проблемы: как доставить экворин внутрь клетки. Экворин - довольно большой белок, плохо проникающий через клеточную мембрану, поэтому основным методом «загрузки» экворина в клетку был гипоосмотический шок. Биолюминесцентный метод позволял исследовать лишь «живучие» клетки, например эритроциты, тогда как более чувствительные клетки, такие как нейроны, загрузить не удавалось.