11. Алгоритм проведения теста активации базофилов

В алгоритм входит исследование спонтанной активации базофилов с буферным раствором (негативный контроль), исследование индуцированной активации базофилов, стимулированной анти-IgE-антителами или fMLP (позитивный контроль) и исследование индуцированной активации базофилов, стимулированной различными аллергенами (тестовая проба). Все этапы проведения теста подробно описаны в инструкциях, прилагаемым к коммерческим тест-системам.

Активация базофилов – процесс, требующий соблюдения ряда условий. При проведении тестов инкубация образцов цельной крови с потенциальными аллергенами в присутствии моноклональных антител для идентификации и определения активации базофилов проводится при оптимальной температуре 37°С в течение 15-20 минут на водяной бане в темноте в присутствии ионов кальция [97]. После этого активацию базофилов останавливают, эритроциты лизируют, лейкоциты стабилизируют реагентами, входящими в набор. После отмывания фосфатно-солевым буфером от дебриса и несвязавшихся антител и ресуспендирования в буфере пробы готовы для исследования методом проточной цитометрии.

В протоколе исследования в соответствии с рекомендациями фирм- производителей наборов проводят оценку 500 базофилов для получения статистически валидных результатов.

В зависимости от тех реагентов, которые использованы в наборе для идентификации базофилов и оценки их активации, протоколы цитометрического анализа различаются. На рис. 2, 3 и 4 показаны примеры поэтапного гейтирования в мультипараметрических протоколах для выделения чистой популяции базофилов с помощью различных комбинаций моноклональных антител.

В случае использования комбинации антител к CD3/CD294/CD203c (Рис.2) в соответствии с инструкцией к набору вначале на гистограмме по параметрам прямого FS и бокового SS светорассеяния отсекается дебрис. Затем выделяется область исследования, где находятся клетки с низкими/средними параметрами бокового SS светорассеяния и негативные по CD3 для исключения Т- лимфоцитов 2 типа иммунного ответа, экспрессирующих CD294.

Следующий шаг – выделение пула базофилов, позитивных по CD294 (CRTH2) и CD203с. В результате многоэтапного гейтирования на последней гистограмме CD203c против CD294 обозначена чисто выделенная популяция базофильных гранулоцитов, на которой в гейте L возможно оценить относительное количество активированных базофилов с фенотипом SSlowCD3^- CD294⁺CD203c⁺⁺⁺, гиперэкспрессирующих молекулу CD203c, от общего числа базофилов SSlowCD3^-CD294⁺CD203c⁺.

Рис.2. Алгоритм выбора целевой зоны для оценки активации базофилов при использовании маркеров CD3, CD294, CD203c.

В случае использования комбинации антител к CD123/HLA DR/CD63 (Рис.3) также вначале на гистограмме по параметрам прямого FS и бокового SS светорассеяния отсекается дебрис. Затем выделяется область исследования, где находятся клетки ярко позитивные по CD123 с низкими/средними показателями бокового SS светорассеяния для отсечения эозинофилов. Следующий шаг – гейтирование базофилов на основании отсутствия экспрессии HLA DR для отсечения моноцитов, экспрессирующих CD123. В результате многоэтапного гейтирования на последней гистограмме CD63 против CD123 обозначена чисто выделенная популяция базофильных гранулоцитов, на которой в гейте Q возможно оценить относительное количество активированных базофилов с фенотипом SSlowCD123⁺HLADR^-CD63⁺ с поверхностной экспрессией молекул CD63 от общего числа базофилов SSlowCD123 ⁺HLADR^-.

Рис.3. Алгоритм выбора целевой зоны для оценки активации базофилов при использовании маркеров CD123, HLA DR, CD63.

В случае использования комбинации антител к CCR3/CD63 (Рис.4) также вначале на гистограмме по параметрам прямого FS и бокового SS светорассеяния отсекается дебрис. Затем выделяется область исследования, где находятся клетки позитивные по CCR3 с низкими/средними показателями бокового SS светорассеяния для отсечения эозинофилов. В результате многоэтапного гейтирования на последней гистограмме CD63 против CCR3 обозначена выделенная популяция базофильных гранулоцитов, на которой в гейте В2 возможно оценить относительное количество активированных

базофилов с фенотипом SSlowCCR3⁺CD63⁺ с поверхностной экспрессией молекул CD63 от общего числа базофилов SSlow CCR3⁺.

Рис.4. Алгоритм выбора целевой зоны для оценки активации базофилов при использовании маркеров CCR3, CD63

Показано [107], что вариабельность результатов теста при использовании определенной тест-системы на цитометрах разных производителей невелика и не превышает 15%.