- PCR-SSP - ПЦР (полимеразная цепная реакция, PCR) с сиквенс-специфическими праймерами (SSP - Sequence Specific Primers).
Метод основан на ПЦР с использованием праймеров, специфичных к конкретным аллелям, например А*26:02:01, или к группам аллелей, например всем аллелям А*26. Праймеры конструируются таким образом, чтобы последовательность, комплементарная аллельному варианту и вид целевого полиморфизма располагалась на 3´-конце. В случае совпадения нуклеотидной последовательностей праймеров с исследуемой ДНК происходит их отжиг на одной из цепей ДНК-мишени с последующей элонгацией в присутствии фермента Taq-полимеразы. Многократное повторение температурных циклов (амплификация) приводит к многократному увеличению количества копий ДНК. Образовавшиеся продукты амплификации ДНК визуализируют с помощью гельэлектрофореза. Учет результатов типирования осуществляется субъективно, исходя из электрофоретической подвижности фрагментов в агарозном геле. В зависимости от выбранных праймеров технология SSP позволяет осуществлять типирование как в низком, так и в высоком разрешениях. HLA-типирование в высоком разрешении возможно только после получения результата в низком разрешении.
Основной недостаток метода PCR-SSP - низкая производительность. За один рабочий день возможно выполнить типирование не более 3-8 образцов по 5 HLA-генам (в зависимости от оснащенности лаборатории). Также имеется высокий риск контаминации помещений лаборатории продуктами реакции амплификации из-за большого количества открытых операций с продуктами ПЦР.
Основные преимущества - простота выполнения, невысокая стоимость (для типирования в низком разрешении) и доступность необходимого оборудования, возможность проведения типирования как в низком, так и в высоком разрешениях. Однако типирование в высоком разрешении требует большого количества дорогостоящих наборов на конкретные группы HLA-аллелей.
- PCR-SSO - метод специфических олигонуклеотидов (SSO - Sequence Specific
Oligonucleotides).
Является автоматизированным методом, использующим специально предназначенное оборудование и программное обеспечение для гибридизации, детекции и определения HLA-генотипа.
Метод SSO основан на гибридизации исследуемого образца ДНК с аллельспецифичными одноцепочечными ДНК зондами. Одноцепочечные ДНК зонды представляют из себя короткие фрагменты ДНК, сконструированные таким образом, чтобы покрывать максимально возможный паттерн из задокументированных аллелей. Анализ комбинации прореагировавших зондов позволяет программному обеспечению сделать заключение об HLA-генотипе исследуемого образца.
На первом этапе осуществляется выделение ДНК с характеристиками концентрации и оптической плотности, зависящими от используемого на этапе детекции анализатора.
Вторым этапом является проведение ПЦР с локус-специфическими праймерами.
На третьем этапе выполняется гибридизация продукта ПЦР с аллельспецифичными одноцепочечными ДНК зондами (SSO), размещенными на различных носителях (нитроцеллюлозных стрипах, микросферах, либо на дне типирующей ячейки), и последующей детекцией прошедших гибридизацию образцов (хемилюминесцентный анализ, лазерная детекция либо колориметрический анализ).
Четвертым этапом является интерпретация полученных результатов, выполняемая при помощи специализированного программного обеспечения.
Использование метода SSO типирования целесообразно для лабораторий с большим потоком образцов, но он мало применим для единичных исследований.
- PCR-SBT - метод, использующий секвенирование по Сэнгеру (Sequence Based Typing).
В основе способа секвенирования по Сэнгеру лежит синтез комплементарных исследуемой последовательности фрагментов ДНК случайной длины, полученных при помощи «терминаторов» полимеразной реакции. Это двухэтапный процесс – первичная ПЦР с локус- или аллель-специфичными праймерами и собственно секвенирующая реакция. При секвенировании происходит отжиг олигонуклеотидного праймера на специфический участок одноцепочечного амплификата, полученного на первом этапе. Дальнейшая элонгация цепи осуществляется в присутствии полимеразы и четырех дезоксинуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP). Терминация цепи происходит из-за наличия в реакционной смеси дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP), каждый из которых мечен флуоресцентным красителем. Продукты реакции секвенирования анализируют с использованием современных автоматических анализаторов, принцип работы которых основан на проведении капиллярного электрофореза фрагментов ДНК, при этом луч лазера возбуждает флуоресценцию красителей, а детектор определяет, какой фрагмент синтезированной ДНК в настоящий момент мигрирует через гель.
Несмотря на то, что метод является достаточно точным, низкая производительность, высокая стоимость и возможные ошибки при анализе гетерозиготных образцов делают его применение ограниченным при проведении массовых исследований.
- HLA-типирование методами NGS (next generation sequencing) - секвенирования нового поколения.
Определение последовательности нуклеиновых кислот (НК) методами высокопроизводительного секвенирования представляет собой одновременное (параллельное) прочтение последовательности нескольких миллионов разных фрагментов исходной ДНК. Общая последовательность этапов высокопроизводительного секвенирования для наиболее популярных технологических вариантов:
- Выделение нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).
- Разрушение НК с помощью химических (ферментативных) или физических методов, для получения фрагментов определенной длины или амплификация продуктов определенной длины (таргетное секвенирование). Большинство методов высокопроизводительного секвенирования использует таргетное секвенирование, основанное на классической ПЦР целевых регионов для дальнейшего массового параллельного секвенирования.
- Присоединение синтетических олигонуклеотидных адаптеров по краям фрагментов (приготовление библиотеки).
- Клональная амплификация. Наработка каждого фрагмента ДНК, например, в отдельном микрореакторе с микрочастицей (эмульсионная ПЦР) и/или непосредственно на поверхности предметного стекла (мостиковая ПЦР).
- Определение последовательности фрагментов ДНК-методами, предложенными производителями приборов.
- Биоинформационный анализ данных.