Выдержка из МУК 4.2.2217-07 «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды: методические рекомендации»
Для выделения легионелл используют стандартную среду - буферный угольно дрожжевой агар (БУДРАГ, ВСУЕа) с ростовой и селективной добавкой. Среды промышленного изготовления готовятся в соответствии с прописями на этикетке или в соответствии с инструкцией изготовителя.
Допускается применение сред лабораторного приготовления.
Отбор проб осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб» и ГОСТ Р 51593-2000 «Вода питьевая. Отбор проб»; МУК 4.2.1018-01 «Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу питьевой воды»; МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов».
Пробы воды объемом 0,5-1,0 литр для микробиологического анализа на наличие легионелл отбирают в стерильные емкости. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.
Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги), или завинчивающимися крышками с резиновыми уплотнителями. Многоразовая посуда, в том числе пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.
С целью дехлорирования воды в стерильные флаконы емкостью 500 мл вносят 2 мл 1,5 % раствора гипосульфита натрия, простерилизованного в автоклаве, или для забора используют емкости, содержащие кристаллы гипосульфита натрия из расчета 20 мг на 1 л воды.
Поверхностные пробы отбирают специальным батометром, предназначенным для этих целей. Глубинные пробы отбирают специальным батометром, предназначенным для этих целей. Допустимо использовать другие приспособления, установленные в приложении к ГОСТ Р 51592-2000.
Забор материала осуществляют стерильно, избегая соприкосновения пробки и края емкости с любыми поверхностями. После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность и не намокающей при транспортировке (ватные пробки не применять), и стерильным колпачком.
Смывы с объектов (оборудования для кондиционирования и вентиляции, водонагревательных и охладительных систем, медицинского инструментария и т.д.) берут тампоном (свабом), смоченным стерильным физиологическим раствором и помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором.
С учетом способности легионелл к образованию биопленок на поверхности водопроводного, промышленного, лабораторного и иного оборудования, связанного с циркуляцией и хранением воды, соответствующие участки поверхности также могут исследоваться на наличие легионелл. Соскобы влажных биопленок с поверхности, находящейся под водой или на границе соприкосновения воды и воздуха, берут сухими тампонами и помещают во флакон или пробирку. Соскобы биопленок с высохшей поверхности берут тампонами, смоченными стерильным физиологическим раствором и помещают в пробирку, содержащую стерильный физиологический раствор.
Отбор проб производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.
Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, времени забора, фамилии специалиста, отбиравшего пробу, и другой информации (температуры воды, погодных условий).
Доставку проб воды осуществляют в контейнерах при температуре 6-24°С. При соблюдении указанной температуры транспортировки и хранения срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 48 часов. Хранение проб в холодильнике при температуре ниже 6 °с может привести к негативным результатам исследования проб в связи с возможным переходом легионелл в некультивируемое cocтoяниe.(Hussong D.et.al.1987) Если проба содержит дезинфектанты, и их нейтрализация не проведена сразу же после отбора, анализ проводят в течение 4 часов после забора.
Идентификация Legionella pneumophila
Легионеллы не ферментируют углеводы, разжижают желатин, не образуют уреазу, не восстанавливают нитраты, положительны в пробе на каталазу, вариабельны в пробе на оксидазу. Отсутствие способности к ферментации углеводов у бактерий Legionella spp. не позволяет быстро и достоверно провести идентификацию легионелл до вида на основе биохимических тестов. Для быстрой идентификации бактерий Legionella pneumophila используют латекс-агглютинацию с моновалентными и групповыми сыворотками и метод флуоресцирующий антител (МФА). В случае необходимости принадлежность выделенной культуры к виду Legionella pneumophila определяют с помощью полимеразной цепной реакции с видоспецифичными праймерами.
Окончательную идентификацию легионелл до вида и серовара проводят в национальной референс-лаборатории по легионеллезу (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва).
Оформление и выдача результатов
Ответ о выявлении в исследуемой пробе легионелл представляют следующим образом:
- Если легионеллы не выявлены в исследуемой пробе: Legionella pneumophila не обнаружена.
- При выявлении Legionella spp.: в исследуемой пробе выявлены Legionella spp.; Legionella pneumophila не обнаружена.
- При выявлении Legionella pneumophila: в исследуемой пробе выявлена Legionella pneumophila в установленном количестве бактерий (геномных копий) на литр.
- При исследовании пробы биопленки: в исследуемой пробе выявлена Legionella spp. или Legionella pneumophila.