Раздел IV. Качество, технологии и безопасность пищи

Прионы

Прионы — субвирусные инфекционные агенты белковой природы, которые не содержат в своем составе нуклеиновых кислот и не обладают автономными механизмами репликации. При развитии заболевания у человека и ряда млекопитающих вызывают образование в клетках нервной ткани фибриллярных белков, структурно абсолютно сходных с патологическим белком амилоидом, накапливающимся в организме человека при амилоидозе. Сегодня к прионовым инфекциям относят трансмиссивные спонгиоформные энцефалопатии (ТСЭ), характеризующиеся медленно развивающимся патологическим процессом («медленная инфекция»), преждевременным старением организма, не поддающимися лечению психоневрологическими расстройствами (выпадение функций органов чувств, параличи, атрофия мышц, депрессии, слабоумие) и фатальным исходом в 100% случаев.

Прионы квалифицируют как принципиально новый, не описанный ранее среди биологических объектов класс возбудителей. Исследования их природы в 60-х гг. XX в. начал нобелевский лауреат Д. Гайдушек для выяснения причин дегенеративных заболеваний мозга и нервной системы у человека (куру) и овец (скрейпи), который доказал их идентичность. Примерно через 20 лет эти работы резко активизировались при возникновении эпизоотии губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (ГЭ КРС) на территории Великобритании, Ирландии и части Европейского континента, приведшей к формированию опасного для человека зооноза — нового варианта болезни Крейтцфельдта–Якоба (нвБКЯ), которая определялась ранее как доминантно-наследуемый предстарческий психоз. В 1997 г. С. Прузинер доказал, что инфекционный агент скрейпи является модифицированной изоформой нормального белка организма хозяина, кодируемого геномом этого организма [1].

Характеристика возбудителя и данные о патогенезе. Путем молекулярного анализа в организме здорового человека в норме был обнаружен белок РrР^с, структурно сходный с патологическим прионовым белком. В дальнейшем кодирующий его ген (PrNP), картированный на коротком плече 20-й хромосомы, был подвергнут мутации, полученный РrР-ген клонирован у трансгенных мышей, которые экспрессировали в качестве продукта прионовый белок — PrPS^c или РrРres. Таким образом было подтверждено, что прион является измененным вариантом нормального белка мозга, сиалогликопротеидом, который вырабатывается нервными клетками и имеет массу 3,5 тыс. Кд. Описаны другие молекулярные формы прионов, представленные более короткими пептидами (с массами от 20 до 3,1 тыс. Кд), как считают, являющиеся фрагментами PrPS^c, способными проникать в клетку и перенаправлять синтез нормального белка РrР^с по пути инфекционно активных прионов PrPS^c. Существует ряд гипотез, среди которых видное место занимают гетеродимерная и полимеризационная модели перехода: например, когда молекула белка РrР^с соединяется с молекулой попавшего во внутреннюю среду организма PrPS^c, образуя гетеродимер, который конформируется в две молекулы приона. В последующие циклы продолжается экспоненциальный логарифмический рост количества прионов, представляя собой in vivo амплификацию с накоплением возбудителя в ЦНС. В начале ХХI в. было предположено, что переход основных α-спиральных доменов РrР^с в результате точечных замен аминокислот или взаимодействия с другими макромолекулами в устойчивую «складчатую» β-структуру PrPS^c и составляет основу патогенеза ТСЭ, хотя этот механизм до конца так и не раскрыт. ТСЭ характеризуются гибелью нервных клеток, образованием на их месте пустот, заполненных жидкостью, разрастанием опорной ткани мозга и формированием амилоидных бляшек, которые создают патогистологическую картину, сходную с изменениями нервной ткани в организме старых животных и старых людей, а макроскопически проявляются ее своеобразной губкообразной инволюцией [2].

Учеными высказывались обоснованные предположения об особой уязвимости к нарушениям конформации негликозилированных РrР^с при недостаточности питательных веществ, когда происходит активизация клеточного механизма аккумуляции данного белка в агрегированной форме PrPS^c, резистентной к клеточным протеазам, по типу адаптации с накоплением резервных белков подобно процессу у низших эукариот [4, 5].

Прионы устойчивы ко всем традиционно используемым дезсредствам, эффективным против вирусов, бактерий и грибов, к антимикробным фармпрепаратам, а также к принятым режимам высокотемпературной пастеризации. Это свойство объясняют измененной пространственной конфигурацией патологического приона, который потерял природную структуру, и поэтому для его инактивации требуются очень сильные воздействия (например, нагревание при 160 °С в течение 24 ч), полностью денатурирующие другие белки. Для дезобработки контаминированных объектов рекомендован 8% раствор гидроксида натрия, с воздействием на возбудителя в течение 1 ч при температуре 20 °С. Относительно эффективен 2% гипохлорит натрия при воздействии в течение 2 ч при температуре 20 °С [6]. Однако имеет значение доза инфекционного приона в обрабатываемом материале — чем она ниже, тем выше ингибирующий эффект. Защитным фактором для макроорганизма выступает также видовой барьер, поскольку для его преодоления нужны очень высокие дозы инфектанта [5].

В то же время структурное сходство прионов с РrР^с обусловливает отсутствие иммунных реакций организма человека и животных на их введение и не позволяет создавать против них вакцины и сыворотки.

Эпидемиология. Аномальный прионовый белок контагиозен независимо от своего происхождения: в экспериментах животные погибали и от прионовых инфекций, и от инокуляции материала из мозга больных наследственными формами таких болезней. В силу социальной и экономической значимости большее внимание уделяется прионовым болезням человека и животных инфекционной природы, объединяемым под общим названием ТСЭ:

– бычья губчатая энцефалопатия (БГЭ), поражающая КРС, в обиходе называемая «коровьим бешенством», в том числе атипичная;

– скрейпи овец и коз, в том числе атипичная;

– хроническая изнуряющая болезнь оленей и лосей (CWD);

– трансмиссивная энцефалопатия норок (TME);

– кошачья губчатая энцефалопатия;

– болезнь Крейтцфельдта–Якоба (БКЯ) и новый вариант БКЯ у человека (нвБКЯ);

– куру (болезнь аборигенов Африки, у которых бытует каннибализм);

– фатальная семейная инсомния;

– синдром Герстманна–Штреусслера–Шейнкера.

Заражение людей прионами происходит двумя независимыми путями:

– от человека к человеку (ятрогенно в результате пересадки трупной роговицы, пахименингса[2], при использовании крови, парентеральных фармпрепаратов, содержащих экстракты тканей человека, гормон роста или другие гормоны гипофиза, а также инфицированных инструментов);

– с пищей (через мясопродукты от КРС, инфицированного агентом vCJD).

По мнению ряда ученых, пищевой путь передачи является основным [3]. Однако в его реализации доказана роль только агента БГЭ, который, передаваясь людям при потреблении контаминированного мяса КРС, обусловливает развитие нвБКЯ, но нет пока никаких научных свидетельств о возможности заражения естественным путем возбудителями других ТСЭ [7].

В документированных случаях ТСЭ с ятрогенной передачей минимальный инкубационный период достигал 10 лет, при передаче с пищей — 1,5–2 лет, а при лечении гормоном роста и гонадотропином — составлял 4–30 лет [2].

Факторами передачи возбудителя при реализации инфекции как зооноза в первую очередь служат так называемые «специфические материалы риска» (СМР), а именно — головной и спинной мозг, нервная и лимфоидная ткани, включая позвоночные ганглии, глаза КРС. Концентрация прионов в других тканях и биологических жидкостях низкая и плохо диагностируется лабораторно.

Причины возникновения БГЭ. Хотя современная проблема прионных инфекций заключается в основном в БГЭ у КРС и нвБКЯ у человека, важно изучать всю группу этих болезней, вызванных одним инфекционным агентом. К началу XXI в. была доказана роль агента скрейпи овец в активизации механизма передачи и в возникновении ТСЭ. Определяющими факторами послужили непродуманные изменения в применяемых безотходных технологиях в животноводстве, кормовой и пищевой индустрии.

На первом этапе таким фактором была реутилизация отходов мясопереработки в кормах для скота и скармливание всем жвачным мясокостной муки (МКМ), изготовленной из вторичного овечьего сырья, а с 1985 г. еще и произвольная, продиктованная только экономическими соображениями отмена рендеринга (вытопки жира раствором гидрокарбоната в потоке пара при выработке МКМ с заменой на сушку с органическими растворителями) на территории Великобритании, страны с отличительно высокой заболеваемостью скрейпи овец (и, соответственно, высокой частотой и концентрацией прионового белка в организме убойных овец). У откармливаемого МКМ КРС это способствовало нагрузке прионом лимфоидного аппарата кишечника, накоплению в фагоцитах, преодолению им видового барьера и инфицированию нервной ткани генетически неустойчивых пород животных. Динамика заболеваемости и ее зависимость от непродуманных техногенных действий и несвоевременных мер по их устранению показаны на рис. 27.17.

Рис. 27.17. Зависимость эпизоотии трансмиссивных спонгиоформных энцефалопатий от техногенных действий в Великобритании [по Brown P.]

Эпизоотия «коровьего бешенства» в Великобритании началась в 1986 г., в 1992 г. она достигла пика, когда регистрировалось по 1000 случаев заболеваний КРС в неделю. Для болезни была характерна прогрессирующая неврологическая симптоматика и летальный исход [4, 8].

На втором этапе не была учтена возможность попадания приона в пищевую цепь: от инфицированного КРС в другой «безотходный» продукт — в вырабатываемое из него мясо механической обвалки (ММО) с деструктурирующимися в процессе технологии лимфоидной и нервной тканью. Соответственно, потребление людьми мясопродуктов, в состав которых входило контаминированное ММО, обусловило передачу прионов человеку. Отсутствие прогнозной оценки риска способствовало завершению цепи последовательностей, приведших к появлению нового фатального зоонозного заболевания человека (нвБКЯ) менее чем за 10 лет.

С 1994 г. в Великобритании, затем во Франции стали регистрироваться случаи смерти от нвБКЯ, отличительной особенностью которого стал возраст заболевших людей — от 16 до 40 лет (классическая БКЯ более чем в 97% случаев развивается у пожилых и старых людей), а также более длительное течение заболевания (в среднем 12–14 мес). По данным CDC (США), в 2006 г. с момента регистрации первого случая нвБКЯ зафиксировано 195 заболеваний в 11 странах, в том числе 162 — в Великобритании, 20 — во Франции, 4 — в Ирландии, 2 — в США, по одному — в Канаде, Италии, Японии, Нидерландах, Португалии, Саудовской Аравии, Испании. При этом 7 человек из Ирландии, США, Японии, Канады и Франции заразились, проживая в Англии в период разгара эпизоотии у КРС. По прогнозам британских эпидемиологов, нвБКЯ могли заразиться от 7 до 50 тыс. человек, которые находятся в инкубационном периоде инфекции [4, 8]. Другую опасность они связывают с возможностью вторичной передачи нвБКЯ от человека-носителя инфекционного PrPS^c к здоровому человеку ятрогенным путем, и такие случаи у реципиентов донорской крови сегодня уже зарегистрированы в Великобритании [9]. На рис. 27.18 приведена географическая схема уровней риска заражения ТСЭ в ряде стран ЕС, пострадавших от эпизоотии БГЭ у КРС.

В настоящее время связь между нвБКЯ и БГЭ доказана гомологичностью генетических маркеров прионов, полученных от погибших в результате БГЭ животных, и прионов, выделенных от людей, больных нвБКЯ. Показав, что 10-летняя корова с атипичной формой БГЭ имела те же мутации прионных генов, что и обнаруженные у людей, страдающих от генетической формы болезни БКЯ, исследователи предположили, что БГЭ у КРС вызывается мутацией гена Prion Protein Gene.

Рис. 27.18. Число случаев трансмиссивных спонгиоформных энцефалопатий среди сельскохозяйственных животных и риск заражения человека новым вариантом болезни Крейтцфельдта–Якоба в ряде стран Евросоюза к началу XXI в. [8]

Что касается выявления ТСЭ у продуктивных животных других видов, в том числе диких (овцы, козы, олени, антилопы, лоси), то, согласно современным представлениям, эти факты свидетельствуют о преодолении прионовыми белками межвидового барьера (чему, кстати, может способствовать персистенция в организме возбудителей бактериальных и вирусных инфекций или токсическое воздействие некоторых пестицидов) и потенциального риска заражения человека [2]. Однако, согласно установленному механизму формирования нвБКЯ как нового зооноза, для нагрузки лимфоидного аппарата кишечника в организм должны поступать высокие дозы прионовых белков, тогда как частота потребления СМР с продуктами от мелкого рогатого скота и диких животных несопоставимо меньше, чем от КРС [10].

Меры профилактики прионовых инфекций. Для предотвращения попадания прионов в пищевую цепь категорически не допускают к переработке и употреблению в пищу мозг и лимфоидную ткань больных животных. В Великобритании эти ткани запрещены к экспорту в любых продуктах из говядины, в том числе при получении от КРС из стад, где не было случаев ТСЭ [11]. Поскольку продемонстрирована инфекционность и других тканей, ФАО/ВОЗ и EFSA запрещают использование мяса больных коров, которое подлежит уничтожению [12, 13].

По официальным данным, в России никогда не регистрировались заболевания БГЭ у КРС и не было ни одного клинического случая нвБКЯ у людей. Также никогда не сообщалось о циркуляции в природе агента скрейпи овец и CWD у оленей, что свидетельствует об отсутствии объективно существующих возможностей для распространения возбудителя. Однако реальная ситуация может быть далеко не простой, учитывая, что РФ импортирует более 50% мясного сырья, в том числе из стран, где ТСЭ у скота периодически регистрируются (например, из Бразилии). Кроме того, специалисты говорят о пока еще недостаточной эффективности методов лабораторного подтверждения прионной природы патологий, диагностируемых в клинике как наследственные формы дегенеративных психоневрологических заболеваний [3] и не учитываемых как ТСЭ.

Во избежание этого в РФ налажена система жестких ветеринарно-профилактических мер, направленных на предотвращение завоза потенциально опасных источников инфекции с продуктами убоя и мясным сырьем:

1) запрет на ввоз из неблагополучных по ТСЭ стран или конкретных регионов племенного скота, мяса, субпродуктов, полуфабрикатов, консервов, МКМ, спермы, эмбрионов, жира, кишечного сырья и кормов животного происхождения от жвачных;

2) тщательный контроль за закупками племенного скота, биологических тканей с учетом эпизоотологической ситуации по ТСЭ в стране изготовителя;

3) запрет скармливания жвачным животным МКМ и костной муки от КРС и овец;

4) запрет на использование кормов и кормовых добавок любого неизвестного происхождения;

5) тщательная диагностика при любом подозрительном случае и лабораторный мониторинг проб мозга убойного КРС, особенно от животных старше 3 лет; ветнадзор/контроль сырья на продовольственном рынке.

Рекомендации ВОЗ о специфических материалах скота, повышающих риск передачи прионовых заболеваний, включены также в ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (Приложение 7, п. 1.3), в котором запрещается использовать в качестве источников сырья для производства биологически активных добавок к пище органы и ткани животных и продукты их переработки, в том числе:

– от КРС — череп, за исключением нижней челюсти, включая мозг и глаза, и спинной мозг животных в возрасте более 12 мес; позвоночный столб, исключая хвостовую часть, остистые и поперечные отростки затылочной, грудной и поясничной частей позвоночника, срединный гребень и крылья крестца, но включая корешковые дорсальные ганглии животных старше 30 месяцев; миндалины, кишечник от 12-перстной до прямой кишки и брыжейку животных всех возрастов;

– от овец (баранов) и коз — череп, включая мозг и глаза, миндалины и спинной мозг животных старше 12 мес или имеющих коренные резцы, прорезавшиеся сквозь десна, селезенка и кишечник животных всех возрастов;

– от жвачных животных — мясо механической обвалки, желатин (за исключением вырабатываемого из шкур), вытопленный жир и продукты его переработки.

Для предупреждения ятрогенной передачи инфекта ТСЭ установлен порядок использования, закупок донорских препаратов, гормональных средств, субстанций и их контроля на наличие прионных белков [14].

Методическая база анализа агентов ТСЭ. Известно более 12 методических технологий исследования биоматериала от больных и подозрительных на заболевание ТСЭ животных и человека. Наиболее доступными среди них признаются патогистологический метод (аутопсия продолговатого и среднего отделов мозга для микроскопического выявления губчатого перерождения нейронов в сером веществе); биопроба на лабораторных животных (белых мышах) с заражением их гомогенатом мозга; иммуногистохимические (определение прионного белка методом иммуноблоттинга) и иммуноферментные (определение антигенов к аномальному белку с флюоресцирующими антителами) методы в экстрактах из тканей мозга, глаза (века), ликвора, крови и мочи; биопсия лимфоузлов с окраской на амилоид [2, 3, 6]. В то же время ни один из них не лишен недостатков: гистологические — из-за пригодности в основном для постмортальной диагностики, биологические — из-за чрезмерной продолжительности, иммунологические — в силу низкой чувствительности тест-систем. Работа по усовершенствованию методов анализа PrPS^c активизировалась в последние 5 лет. Она направлена на повышение чувствительности иммунометодов (путем концентрации патогена в образце с применением магнитных частиц, специфических пептидов и биосенсоров), а также на создание однодоменных моноклональных антител на основе рекомбинантных РrРс и PrPS^c, разработку инновационного теста РМСА (protein misfolding cyclic amplification) — циклической амплификации прионов, при которой происходит концентрация активного участка PrPS^c молекулы в пробирке.

Заключение. Учитывая фатальность зоонозов прионной природы целесообразным подходом к их профилактике могла бы стать эрадикация ТСЭ в энзоотичных странах и регионах. Для этого необходимо дальнейшее усовершенствование национальных профилактических мероприятий и планирование прогнозных научных исследований в сфере медицины и ветеринарии. Наиболее перспективными направлениями могут стать селекция и разведение пород овец, коз, КРС, генетически устойчивых к TSE, оценка риска при использовании различных белков животного происхождения у жвачных, разработка методов доклинической диагностики TSE у людей и животных.

Литература

1. Prusiner S.B. A Unifying Role for Prions in Neurodegenerative Diseases// Science. 2012. Vol. 336. P. 1511–1512;
2. Турьянов М.Х. Острые, хронические и медленные инфекции человека// Врачебная газета. 2000. № 2 (5).
3. Зуев В.А. Прионы — возбудители медленных инфекций человека и животных // РМЖ. 2010. № 6. С. 381. URL: http://www.rmj.ru/articles/infektsiya/Priony_ vozbuditeli_medlennyh_infekciy_cheloveka_i_ghivotnyh/#ixzz4XZL6TskD.
4. Brown P. Transmissible spongiform еncephalopathy as a zoonotic disease // Transmissible Spongiform Encephalopathy as a Zoonotic Disease. ILSI Europe Report Series, 1.1.2003. URL: http://ilsi.eu/wp-content/uploads/sites/3/2016/06/R2003Tran_Spon.pdf.
5. Афанасьева Е.Г., Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д. Межвидовая передача прионов // Успехи биол. химии. 2011. № 51. С. 3–24.
6. Ветеринарная служба Владимирской области. URL: http://vetvo.ru/gubkoobraznaya-encefalopatiya-krupnogo-rogatogo-skota.html.
7. EFSA (European Food Safety Authority), 2016 // Annual Report of the Scientific Network on BSE-TSE 2016 EFSA Supporting Publication, 2016. EN-1149. 11p. doi: 10.2903/sp.efsa.2016. EN–1149.
8. Знойко О.О. Прионные болезни человека, 2013. URL: http://present5.com/prezentaciya-prionnye-bolezni/
9. Gill O.N., Spencer Y., Richard-Loendt A., Kelly C. et al. Prevalent abnormal prion protein in human appendixes after bovine spongiform encephalopathy epizootic: large scale survey // BMJ. 2013. Vol. 347. Article ID f5675. doi: 10.1136/bmj.f5675.
10. Chronic wasting disease (CWD) in cervids // EFSA J. 2017. Vol. 15, N 1. Article ID 4667. 62 p. doi: 10.2903/j.efsa.2017.4667.
11. BSE Bull. No. 52, November 2000. URL: http://www.maff.gov.uk/animalh/bse/index.html.
12. URL: http://www.fao.org/livestock/AGAP/FRG/FEEDSAFETY/PDFs/bsebull.pdf.
13. Brown P., Will R.G., Bradley R. et al. Bovine spongiform encephalopathy and variant Creutzfeldt-Jakob Disease: background, evolution, and current concerns // Emerg. Infect. Dis. 2001. Vol.7. P. 6–16.
14. Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 № 916 (ред. от 18.12.2015) «Об утверждении Правил надлежащей производственной практики» (зарегистрировано в Минюсте России 10.09.2013 № 29938 г.).

[1] Биологически активные вещества.