ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ
ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Цитогенетическое исследование включает следующие основные стадии:
— получение препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови;
— окрашивание препаратов;
— микроскопический анализ и обработка результатов.
Для получения препаратов хромосом в заранее приготовленные стерильные пробирки с гепарином вносят 5-6 мл крови и закрывают стерильной пробкой. Для постановки культуры обычно используют цельную кровь, можно также использовать плазму, обогащенную лейкоцитами. В соответствующих пособиях и руководствах методы цитогенетических исследований описаны достаточно подробно, отметим лишь общую схему.
Полученную кровь (0,5 мл на 4,5 мл культуральной смеси) культивируют в термостате при температуре 37 °С. Культуральная смесь состоит из питательной среды (типа RPMI-1640, Игла или 199) с добавлением 15-17% сыворотки (крупного рогатого скота, телячьей или эмбриональной телячьей), 2 мМ глутаминовой кислоты и антибактериальных препаратов (бензилпенициллин 100 МЕ/мл, стрептомицин 0,1 мкг/мл). В норме лимфоциты практически не делятся, т.е. находятся в стадии G0 клеточного цикла. Для того чтобы перевести их в стадию G1, в культуральную смесь необходимо добавить фитогемагглютинин, стимулирующий процесс деления. Интерфазные хромосомы невозможно наблюдать в обычный световой микроскоп, а вот в митозе при делении благодаря высокой степени компактизации хромосомы становятся видимыми. Для накопления клеток на стадии метафазы митоза используют ингибиторы образования веретена деления - колхицин или колцемид.
По окончании инкубации проводят фиксацию смесью метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, но перед фиксацией клетки выдерживают в гипотоническом растворе калия хлорида (0,56%); время гипотонической обработки должно составлять 20-25 мин. После нескольких смен фиксатора клеточный осадок приобретает белый цвет. При последней промывке удаляют супернатант, оставляя примерно 0,25-0,5 мл клеточной суспензии.