II. ГЛАВА 3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

II.3.1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ХРОМАТОГРАФИИ

Задача, с которой биохимикам постоянно приходится встречаться при исследовании биологических соединений, - это их выделение и очистка. Одним из наиболее удобных методов разделения является хроматографический. Хроматография - метод разделения и анализа смеси веществ (сорбатов), основанный на различной сорбции компонентов анализируемой смеси определенным сорбентом; метод, с помощью которого можно разделять как большие (несколько граммов), так и малые (пикограммы) количества материала. Выбор того или иного вида хроматографии зависит от природы выделяемого материала. Зачастую для достижения необходимой степени очистки приходится последовательно применять несколько хроматографических методов. Со времени изобретения хроматографии как аналитического метода исследования (см. Анализ) появилось множество его модификаций, что значительно расширило область его применения. В последующих разделах дано краткое описание основных видов хроматографии, широко применяющихся в биохимической практике.

Мысль о том, что адсорбция в динамических условиях улучшит разделение сложных смесей, впервые возникла у М.С. Цвета. Исходя из этой идеи, он в 1903 г. предложил новый метод анализа таких смесей, названный им хроматографическим.

Сущность метода заключается в следующем. Раствор исследуемой смеси вводят в «хроматографическую колонку» - стеклянную трубку, заполненную адсорбентом, предварительно промытым, а затем пропитанным растворителем. Компоненты смеси адсорбируются⁵⁴ в верхней части колонки, не разделяясь или разделяясь лишь частично; образуется первичная хроматограмма (рис. II.3.1, а). Затем ее «проявляют». Для этого в колонку подают чистый растворитель (элюент), который десорбирует ранее адсорбированные вещества и перемещает их со своим потоком вниз по колонке. При движении по колонке происходят многократные акты адсорбции и десорбции, приводящие к разделению компонентов смеси. В соответствии с законом адсорбционного замещения, если растворенные вещества А, В, С по своему относительному сродству к адсорбенту образуют адсорбционный ряд А > В > С, тогда каждый из членов этого ряда вытесняет последующий и, в свою очередь, вытесняется предыдущими, более сильно адсорбирующимися. В результате на колонке образуется проявленная хроматограмма (рис. II.3.1, б). Продолжая промывание колонки растворителем, достигают выхода из нее разделяющихся веществ, которые обнаруживают путем анализа последовательных порций вытекающего из колонки раствора (элюата). Если построить выходную кривую, т.е. график зависимости концентрации элюата (С) от объема пропущенного через колонку раствора (V), то на этой кривой выходу компонентов исходной смеси из колонки будут соответствовать хроматографические пики (рис. II.3.1, в). Часто не происходит полного разделения компонентов, и отдельные пики взаимно перекрываются. Построение выходных кривых является наиболее распространенной формой регистрации колоночной хроматографии, так как не связано ни с окраской разделяемых компонентов, ни с цветом адсорбента.

Рис. II.3.1. Схема хроматографического процесса: а - первичная хроматограмма; б - проявленная хроматограмма; в - выходная кривая проявительного анализа; А, Б - растворенные вещества

⁵⁴ По характеру поглощения сорбата сорбционные явления делятся на 2 типа: адсорбцию - концентрирование сорбата на поверхности раздела фаз или его поглощение поверхностным слоем сорбента и абсорбцию - объемное поглощение, при котором сорбат распределяется по всему объему сорбента. Различают 2 типа адсорбции: физическую адсорбцию, при которой повышение концентрации сорбата на поверхности раздела фаз обусловлено неспецифическими (т.е. не зависящими от природы веществами) силами Ван-дер-Ваальса (см. Ван-дер-Ваальсовы силы), и химическую адсорбцию (хемосорбцию), обусловленную протеканием химических реакций сорбата с веществом поверхности сорбента. Физическая адсорбция слабоспецифична, обратима, и ее тепловой эффект невелик. Хемосорбция избирательна, обычно необратима, и ее теплота составляет от десятков до сотен кДж/моль (хемосорбция кислорода на металлах).