2. НОВЫЕ МЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА (описание методик)

Методика масс-спектрометрии использовалась для исследования конечного продукта окисления липидов (малоновый диальдегид - МДА) и естественных антиоксидантов, содержащихся в пищевых продуктах: - жирорастворимых витаминов (А, Е, 25-ОН-Д3); - ненасыщенных жирных кислот.

Измерение концентрации МДА проводили в пробах плазмы крови [5]. Для этого использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием и оборудование: жидкостной хроматограф типа «1200 Series» фирмы «Agilent Technologies» с диодной матрицей (рис.1). Идентификацию аналита осуществляли по времени удерживания и спектру, регистрируемому с помощью диодно-матричного детектора в диапазоне длин волн 400-600 нм. Для обнаружения аналита проводили дериватизацию с использованием тиобарбитуровой кислоты. Подвижная фаза: ацетонитрил-вода, градиентный режим элюирования; диодноматричный детектор. Колонка «Zorbax SB C18» фирмы «Agilent» (2,1×150 мм, 3,5 мкм) с соответствующей предколонкой. Температура колонки и детектора - 30ºС, λ=532 нм, скорость потока – 0,5 мл/мин, ввод пробы – 20 мкл, время анализа – 6 мин. Количественное определение проводили методом градуировочного графика.

Рис. 1. Высокоэффективный жидкостный хроматограф «1200» («Agilent Technologies», США) с диодно-матричным детектором.

Типичная хроматограмма образца плазмы крови при определении малонового диальдегида представлены на рис. 2.

Рис. 2. Хроматограмма образца плазмы крови при определении малонового диальдегида. где - MDA-TBA – триметиновый комплекс малонового альдегида и тиобарбитуровой кислоты.

Измерение массовой концентрации жирорастворимых витаминов A, E и 25 ОН-Д3 в пробах плазмы крови проводилось с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа «1200» («Agilent Technologies», США) с диодно-матричным детектором и масс-спектрометром с тройным квадруполем «Agilent 6400» (рис. 3), согласно разработанной нами методики [5].

Рис. 3. Высокоэффективный жидкостный хроматограф «Agilent 1200» с диодноматричным детектором и масс-спектрометром с тройным квадруполем «Agilent 6400» (Agilent Technologies, США).

Идентификацию жирорастворимых витаминов (A, E, 25-ОН-Д3) осуществляли по времени удерживания и спектру, регистрируемому с помощью диодно-матричного детектора в диапазоне длин волн 200-400 нм. Колонка «Zorbax Eclips Plus C18» 100 мм x 4,6 мм x 3,5 мкм с предколонкой «Zorbax Eclips Plus C18» 12,5 мм x 4,6 мм x 5 мкм. Скорость элюирования 0,4 мл/мин. Подвижная фаза А: вода + 0,1 % муравьиной кислоты, Подвижная фаза Б: метанол. Количественное определение проводили методом градуировочного графика.

Регистрировали хроматограммы по длинам волн, соответствующим максимальному поглощению для жирорастворимых витаминов А и Е (витамин А - 318 нм, витамин Е – 292 нм), а также масс-хроматограммы, соответствующие переходу масс 401.3→383.3 для витамина 25-ОН-Д3.

В условиях автоматической регистрации и обработки данных определяли (в усл. ед.) площадь пиков жирорастворимых витаминов (A, E, 25-ОН-Д3). Массовую концентрацию жирорастворимых витаминов (A, E, 25-ОН-Д3) вычисляли по установленной ранее градуировочной зависимости. Типичные хроматограммы образцов плазмы крови при определении жирорастворимых витаминов А, Е и 25-ОН-Д3 представлены на рис. 4-6.

Рис. 4. Хроматограмма образца плазмы крови витамина А, λ = 318 нм.

Рис. 5. Хроматограмма образца плазмы крови витамина Е, λ = 292 нм.

Рис. 6. Хроматограмма образца плазмы крови витамина 25-ОН-Д3, MRM 401.3→383.3.

Измерение массовой концентрации полиненасыщенных жирных кислот (омега-3, омега-6) в пробах плазмы крови проводилось методом хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа «Agilent 7890» с масс-селективным детектором («Agilent Technologies», США) (рис. 7).

Рис. 7. Газовый хроматограф «Agilent 7890» с масс-селективным детекторам («Agilent Technologies», США).

Определение концентрации полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) осуществляли по времени удерживания и характеристическим ионам, установленным при предварительной градуировке прибора, в режиме регистрации индивидуальных ионов (SIM). Хроматографическое разделение пробы осуществлялось на капиллярной колонке Select FAME («Agilent Technologies», США) длиной 100 м и внутренним диаметром 0,25 мм, газноситель - гелий. Режим анализа – программированный, скорость нагрева термостата колонки 20 ºС/мин в диапазоне 80 – 160ºС. Выдержка при начальной температуре 1 мин. Скорость нагрева термостата колонки 1 ºС/мин в диапазоне 160-198ºС. Скорость нагрева термостата колонки 5ºС/мин в диапазоне 198–250 ºС, выдержка при конечной температуре 15 мин. Температура испарителя – 220ºС, интерфейса – 250ºС. Более подробно методика описана в разработанных нами Методических рекомендациях [5].

Для количественного определения концентрации определяемого вещества использовалось автоматическое интегрирование хроматограмм с помощью программного обеспечения фирмы «Agilent Technologies», США, MSD Chem Station.

Концентрация ПНЖК вычислялась по установленной ранее градуировочной зависимости. Калибровочные кривые охватывали весь диапазон концентраций ПНЖК, возможный в биологических пробах пациентов (арахидоновая кислота 30÷250 мкг/мл, линолевая кислота 250÷800 мкг/мл, αлиноленовая кислота 1÷50 мкг/мл, докозагексаеновая кислота 5÷50 мкг/мл, эйкозапентаеновая кислота 1÷150 мкг/мл, эруковая кислота 1÷100 мкг/мл, нервоновая кислота 5÷50 мкг/мл, цис-вакценовая кислота 5÷50 мкг/мл, эйкозеновая кислота 1÷75 мкг/мл.