Функциональная активности микробиоценоза ротоглотки определяется по критериям, которые рассчитываются из данных по концентрациям короткоцепочечных жирных кислот в слюне: уксусная (С2), пропионовая (С3), масляная (С4), валериановая (С5), капроновая (С6), изомасляная (iС4), изовалериановая (iC5), изокапроновая (iC6). Короткоцепочечные жирные кислоты являются продуктами метаболизма микробиоценоза ротоглотки и характеризуют его функциональную активность, структуру и протеолитическую активность. Определение концентраций КЖК производится методом газожидкостной хроматографией.
Методика определения концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне
Для хроматографии использовали следующую пробоподготовку.
В пластиковую центрифужную пробирку объемом 15 мл. пациент самостоятельно собирает 2 – 5 мл. слюны. После взвешивания собранной слюны к ней приливают 1 мл. водного раствора ,-диметилмасляной кислоты в концентрации 1 мг/мл, которую используют в качестве внутреннего стандарта. Далее к смеси приливают 1 мл. 40% водного раствора хлорной кислоты (HClO4) и 1 мл. 0,1Н водного раствора соляной кислоты, закрывают пробкой и гомогенезируют смесь, при помощи энергичного встряхивания. Полученный гомогенезат центрифугируют 10 мин. при 6 000 об./мин. Супернатант (надосадочную жидкость) отбирают для внесения в испаритель хроматографа.
Хроматография проводилась на газовом хроматографе Кристалл 5000.2 методом прямого ввода подкисленного супернатанта слюны в испаритель с капиллярной колонкой ZB-FFAP (Zebron) диаметр - 0,32 мм, длина - 30 м, толщина слоя неподвижной фазы – 0,50 мкм и детектором пламенноионизационного типа. Газ - носитель азот. Температурный режим термостата колонки – изотерма 155оС. Температура испарителя и детектора - 250оС. Скорость газа носителя – 60 см/сек при давлении газа носителя 136 кПа. Деление потока газа носителя - 1:35. Расчёт концентраций проводился по методу внутреннего стандарта. Идентификация КЖК проводилась по временам удержания пиков.
Расчет пиков проводят с помощью компьютерной программы прибора путем анализа последовательности пиков, их границ и высот. Площади пиков определяются как площади треугольников с основанием равным ширине пика и высотой равной высоте пика. Исходя из площади пика стандарта (,диметилмасляной кислоты) с известной концентрацией и по соотношениям площадей анализируемых пиков, рассчитывают концентрацию каждого компонента смеси КЖК. В формуле расчета используют также коэффициенты горения, которые являются коэффициентами перевода молярной концентрации в весовую. Концентрации отдельных компонентов рассчитывают по формуле:
ݐ