Рекомбинантный белок (от англ. recombinant protein) — белок, состоящий из аминокислотных последовательностей различных природных белков, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные белки широко используются в медицине как для лечения и профилактики заболеваний, так и в диагностических целях.
Многие белки высших эукариот содержатся в естественных источниках (в частности, в организме человека или животного) в очень незначительных, следовых количествах. Методами генной инженерии можно ввести соответствующие гены, ответственные за синтез таких белков, в клетки микроорганизмов или млекопитающих и получить экспрессию этих генов.
Например, в клетках E. сoli получена экспрессия около 70 различных белков: инсулина, соматостатина, энкефалина, интерферона, гормона роста человека (соматотропин), антигена вируса гепатита В, вируса ящура и т.д.
Ряд компаний налаживают производство белков с помощью рекомбинантных дрожжей. Дрожжи имеют преимущества по сравнению с E. сoli:
- наличие секреторных систем, благодаря которым можно получать внеклеточные белки;
- отсутствие токсичных веществ, которые имеются у E. сoli.
В организме человека вырабатывается множество различных соединений, которые участвуют в регуляции метаболических процессов. Важное место среди таких соединений занимают гормоны. Большинство гормонов ранее получали из трупного материала или из органов животных, однако в настоящее время разработаны генно-инженерные методы их получения.
Получение инсулина
Инсулин — гормон белковой природы, вырабатываемый Р-клетками ПЖЖ для поддержания гомеостаза глюкозы в крови. Недостаток инсулина в крови вследствие приобретенных или наследуемых факторов приводит к заболеванию СД. Это системное заболевание, следствием которого является высокое содержание глюкозы в крови, вызывает поражение многих внутренних органов и систем организма, что неизбежно ведет к ухудшению качества жизни, а без лечения — к смерти. СД называют «болезнью цивилизации», так как первые его описания относятся к античным временам. Инсулин относится к жизненно важным лекарственным средствам, которые Всемирная организация здравоохранения рекомендует самостоятельно производить тем странам, население которых превышает 50 млн человек.
Впервые инсулин был выделен в чистом виде и применен для лечения в 1921 г., а уже в 1923 г. начато его массовое производство. В то время единственным доступным для промышленного использования источником инсулина были ПЖЖ крупного рогатого скота и свиней, поступавшие с боен. По мере накопления данных о последствиях инсулинотерапии выяснилось, что у большого количества пациентов по мере применения животного инсулина развивается ряд серьезных осложнений: снижается чувствительность к вводимому инсулину, что приводит к постоянной корректировке вводимой дозы; проявляются различные аллергические реакции; накапливаются антитела к инсулину и т.д. Данные проблемы связывали с развитием иммунной реакции, которая вызвана структурными отличиями инсулина человека от животных инсулинов. Только в 1955 г. Сенгером была установлена структура инсулина и определена последовательность аминокислот в двух полипептидных цепях А и В (рис. 8.1, см. цв. вклейку).
Инсулин — пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей: А-цепь — из 21 аминокислотного остатка, В-цепь — из 30 аминокислотных остатков. Цепи А и В связаны бисульфидными —S—S-связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. При синтезе инсулина в ПЖЖ вначале образуется предшественник инсулина — проинсулин, который состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина, и проинсулин переходит в активный инсулин.
Инсулин свиньи и быка (крупного рогатого скота) отличается от инсулина человека по аминокислотному составу. Бычий инсулин отличается по аминокислотам в трех положениях, а свиной — в одном положении (положение 30 в цепи В). Именно поэтому неудивительно, что при лечении бычьим инсулином с побочными иммунологическими реакциями приходится сталкиваться гораздо чаще, чем при терапии свиным или человеческим инсулином.
Человеческий инсулин можно производить следующими способами:
- полным химическим синтезом;
- экстракцией из ПЖЖ человека;
- полусинтетическим;
- биосинтетическим.
Первые два способа не подходят из-за неэкономичности, недостаточной разработанности первого способа и недостатка сырья (ПЖЖ человека) для массового производства вторым способом.
Препараты инсулина человека, применяемые для лечения в настоящее время, получают либо полусинтетическим методом с помощью химико-ферментативной замены В-30 — аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин, либо биосинтетическим способом по генно-инженерной технологии. Оба метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки. Это доказано многочисленными дорогими и высокочувствительными аналитическими методами.
Полусинтетический метод имеет то преимущество, что для получения исходного вещества, то есть свиного инсулина, можно прибегнуть к давно и хорошо известным, усовершенствованным способам изготовления и очистки. Теоретически к «загрязнению» конечного продукта ведет лишь попадание в него остатков ферментов или побочных продуктов полусинтеза, возникающих в процессе энзиматической замены одной аминокислоты. Однако появлению таких вторичных примесей в препарате инсулина можно воспрепятствовать путем соответствующего контроля качества. Недостаток полусинтетического метода заключается в постоянной зависимости производства от исходного сырья — свиного инсулина.
Для биосинтетического производства человеческого инсулина были предложены различные способы. Необходимый генный материал переносят в клетки микроорганизма, которые начинают синтезировать предшественников инсулина. Чаще всего применяют один из двух следующих способов: