Глава 4. Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции

В биотехнологическом производстве лекарственных средств основной целью является получение максимального количества целевого продукта. Однако биообъект (микробная, растительная, животная клетка) в соответствии со своей целевой задачей поддерживает собственный гомеостаз, совершая определенный цикл развития, ориентируясь и воздействуя на который можно оптимизировать процесс по­лучения новых средств. Наиболее значимыми в производственном отношении молекулярными механизмами внутриклеточной регуляции являются индукция и репрессия синтеза ферментов, ретроингибирование, строгий аминокислотный контроль метаболизма, регуляция усвоения азотсодержащих соединений, катаболитная репрессия, «суицидный» эффект и др.

Индукция и репрессия синтеза ферментов

Микробная клетка, являясь продуцентом лекарственных веществ, содержит тысячи ферментов, регулируя активность которых можно изменить и процесс синтеза целевого продукта.

В микробной клетке выделяют две основные группы ферментов: конститутивные и индуцибельные. Конститутивные ферменты присутствуют в клетке на протяжении всего цикла жизнедеятельности в строго определенной концентрации. Индуцибельные (адаптивные) ферменты обеспечивают приспособление организмов к меняющимся условиям внешней среды. Например, индуцибельные ферменты образуются в клетке в случае появления в среде противомикробных веществ, которые подвергаются инактивации под действием образовавшихся ферментов.

Регулируя концентрацию ферментов, можно оказывать влияние на интенсивность биотехнологического процесса. В основе данного процесса лежит концепция регуляции индукции и репрессии синтеза ферментов, предложенная еще в 1960-х годах Ф. Жакобом и Ж. Моно на примере «модели оперона», включающей несколько компонентов:

• структурный ген, кодирующий структуру белка (иногда последовательно расположены несколько структурных генов, кодирующих ферменты одной метаболической цепи);
• оператор, который предшествует работе структурных генов и конт­ролирует ее, являясь участком для связывания с белком-репрессором;
• ген-регулятор, который расположен вне оперона и может находиться даже в другой хромосоме;
• промотор, с которым связывается РНК-полимераза для инициации процесса транскрипции и образования иРНК, служащей в рибосоме матрицей для конкретного белка.

Принципиально важно, что оператор располагается между участком, именуемым промотором, и структурным геном (рис. 4.1).

Рис. 4.1. Схемы индукции (а) и репрессии (б) фермента: РНК — рибонуклеиновая кислота

Белок-репрессор, находясь на операторе, тормозит движение РНК-полимеразы, и структурный ген не считывается. Когда репрессор удаляется с оператора, репрессия сменяется индукцией, РНК-полимераза перемещается по структурному гену. Для удаления репрессора применяют метод его инактивации индуктором.

Применение механизмов индукции и репрессии образования ферментов в производственной биотехнологии позволяет поддерживать оптимальный уровень активности необходимых ферментных систем, включенных в биосинтез определенного целевого продукта. Например, в геноме рекомбинантного микроорганизма E. сoli создается оперон с общим промотором и оператором для гена индуцибельной â-галактозидазы и гена человеческого инсулина. E. сoli культивируют на среде, обогащенной лактозой, утилизация которой зависит от синтеза â-галактозидазы. В итоге опосредованно инициируется синтез цепей инсулина.

Ретроингибирование и преодоление этого явления

Как правило, перечень и внутриклеточное соотношение первичных и вторичных метаболитов в клетке строго сбалансированы. При изменении условий культивирования клетки данные параметры меняются в соответствии с интересами клетки, что не всегда совпадает с интересами биотехнолога, который стремится к максимальной наработке определенного вещества. Так, например, при наработке значительной концентрации целевого продукта включается механизм внутриклеточной регуляции — ретроингибирование, защищающее клетку продуцента от переизбытка метаболитов в результате подавления конечным продуктом активности первого фермента метаболической цепи.

Явление ретроингибирования заключается в следующем: концентрация конечного метаболита постепенно достигает максимума и становится достаточной для удовлетворения нужд клетки, образовавшийся метаболит начинает блокировать собственный биосинтез по принципу отрицательной обратной связи, подавляя активность первого фермента всей цепи метаболизма. В основе процесса лежит обратимое взаимодействие конечного продукта с аллостерическим центром фермента за счет образования водородных связей. Далее по мере расходования концентрация метаболита в клетке понижается, и как только она достигает нижнего предела, синтез его запускается вновь.

Биотехнолог имеет возможность «заставить» клетку постоянно синтезировать метаболит, либо непрерывно удаляя образующийся метаболит из питательной среды (путем внесения в среду сорбента), либо используя генно-инженерные продуценты с мутацией в аллостерическом центре начального фермента метаболической цепи.

Ярким примером является процесс биосинтеза пенициллина продуцентом Penicillium chrysogenum с применением комплексной среды, обогащенной лизином; при этом лизин — первичный метаболит, пенициллин — вторичный. Аминоадипиновая кислота, являясь одним из предшественников лизина, входит и в состав LLD-трипептида, из которого в последующем формируется молекула пенициллина. Высокое содержание лизина приводит к подавлению не только собственного биосинтеза по механизму ретроингибирования, но и биосинтеза аминоадипиновой кислоты, а следовательно, и пенициллина.

Строгий аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов и его значение при получении лекарственных средств

Ряд лекарственных препаратов по химической структуре относится к группе производных пуринов и пиримидинов — азотистых оснований нуклеиновых кислот. При производстве лекарственных препаратов указанных групп биотехнологу приходится учитывать явление строгого аминокислотного контроля метаболизма клетки.

Строгий аминокислотный контроль метаболизма клетки позволяет ей адаптироваться к меняющимся условиям, не только выживая, но и интенсивно накапливая биомассу. Строгий аминокислотный кон­троль осуществляется с участием рибосомы как «сенсорной» органеллы и биорегулятора гуанозинтетрафосфата, который играет регулирую­щую роль в переключении метаболизма клетки при переносе с бедной питательной среды на богатую и наоборот.