Глава 1. Культура клеток млекопитающих и человека
Работы по культивированию клеток млекопитающих in vitro впервые были проведены в начале XX в., и связаны они прежде всего с такими пионерами этой области, как Росс Гаррисон, Алексис Каррель и Монтроз Берроуз. Росс Гаррисон в 1907 г. разработал подходы к культивированию тканей животных и показал в системе «висячая капля» в лимфе лягушки рост нервных отростков из фрагментов нервных ганглий in vitro. Монтроз Берроуз и Алексис Каррель в сотрудничестве с Россом Гаррисоном усовершенствовали предложенную технологию культивирования тканей млекопитающих и человека: заменили лимфу на плазму крови, предложили культивирование в прикрепленном виде на адгезивных подложках. Позже Алексис Каррель увеличил сроки культивирования до нескольких месяцев за счет замены ростовой среды и добавления в плазму крови экстрактов эмбриональных тканей. И хотя общепризнано, что Каррель — первый человек, культивировавший клетки млекопитающих in vitro, есть данные, что чуть раньше, в 1908 г., Маргарет Рид получила культуры костного мозга (КМ) морской свинки.
Несомненно, успехи поддержания жизнеспособности клеток и тканей in vitro связаны с разработками питательных ростовых сред. Пионерские изобретения простых солевых растворов относятся к концу XIX — началу XX вв. и связаны с именами Сиднея Рингера, Фрэнка Локка, Мориса Тироде, Ганса Кребса, Джорджа и Маргарет Гей, Вильяма Эрла и Джона Хенкса. Предложенные ими растворы Рингера, Локка, Тироде, Кребса–Рингера, Гея, Эрла и Хенкса основаны на комбинациях неорганических солей, иногда с добавлением глюкозы, приближены по рН и осмолярности к естественным физиологическим условиям и позволяют краткосрочно, до нескольких дней, поддерживать жизнеспособность клеток и тканей in vitro. Параллельно шли разработки многокомпонентных сред с добавлением белков, аминокислот, гормонов и факторов роста (ФР) для увеличения сроков культивирования и поддержания пролиферации клеток в культурах. Но долгое время не было возможности отойти от добавления в ростовые среды животных компонентов, таких как экстракты тканей, плазма и сыворотка. Дальнейшее совершенствование ростовых сред пошло двумя путями: 1) очистка сыворотки и добавление определенных фракций в минимально необходимом для пролиферации клеток количестве; 2) получение полностью синтетических сред известного состава. В первой стратегии пионером является Глен Фишер, который использовал низкомолекулярную фракцию сыворотки после диализа и показал необходимость аминокислот для поддержания жизнеспособности клеток. На основе этих данных и используя полученные ранее первые линии клеток фибробластов мыши и HeLa, Гарри Игл в 1955 г. предложил минимальную необходимую среду — minimum essential medium — MEM, включающую глюкозу, 6 неорганических солей, 13 аминоксилот, 8 водорастворимых витаминов и диализ сыворотки. Позже Ренато Дульбекко, Маргарита Фогт, Клиффорд Станнерс, Норман Исков и др. меняли состав MEM для других типов клеток. Первые синтетические среды связаны с именем Филипа Уайта, который в 1946 г. разработал среду, содержащую глюкозу, неорганические соли, витамины и глутатион, для культивирования фибробластов и кардиомиоцитов цыпленка. Позже, в 1950 г., Раймонд Паркер предложил среду 199. Первые синтетические среды были сложны, многокомпонентны и, как правило, поддерживали рост лишь отдельных линий клеток. С конца 1970-х гг. бессывороточные ростовые среды стали делать для различных типов клеток с добавлением ФР, селена, инсулина и трансферрина. Были разработаны многочисленные заменяющие сыворотку добавки, например B27 supplement для нервных клеток.
Выделенные из тканей культуры клеток до начала субкультивирования носят название «первичные культуры». Как правило, первичные культуры гетерогенны и содержат различные типы клеток, представленные в исходной ткани — источнике. Распространенным и широко используемым и поныне подходом получения первичных культур является механическое измельчение ткани на кусочки объемом до 1 мм3. До сих пор такой способ получения мультипотентных мезенхимных стволовых/стромальных клеток (МСК) считают наиболее перспективным за простоту, универсальность, отсутствие протеолитического стресса, низкий риск контаминации и сохранение поддерживающей стволовые клетки (СК) ниши в тканевых эксплантатах. Подходы к ферментативной дезагрегации тканей и ее фрагментов при получении первичных культур клеток развиваются также с начала XX в. В 1916 г. Роуз и Джонс предложили обработку тканей эмбрионов цыпленка и крысы трипсином для получения суспензии единичных клеток с последующим введением первичных культур. Применение трипсина для субкультивирования и пассирования культур клеток вошло в практику с 50-х гг. XX в. после работ Дульбекко на культурах фибробластов цыпленка. Добавление антибиотиков при выделении первичных культур и в ростовые среды позволило снизить риски контаминации и увеличить сроки культивирования.
Большинство клеточных типов пролиферируют при культивировании в форме монослоя, прикрепившись к адгезивному субстрату (обработанные пластик или стекло, фидерный слой). Некоторые культуры, чаще трансформированные и кроветворные клетки, могут пролиферировать в суспензии. Субкультивирование позволяет продлить сроки ведения культур клеток, выделить однородные популяции и в конечном счете получить линии клеток. Монослойная первичная культура при пассировании за счет открепления от субстрата с применением фермента трипсина или его аналогов и последующего разведения суспензии клеток может быть перенесена на культуральные сосуды с большей площадью поверхности. Для суспензионных культур при пассировании достаточно разведения суспензии. После первого пассирования первичная культура клеток становится вторичной культурой, по формальным признакам это уже линия клеток. После нескольких пассирований культура клеток либо погибает за счет ограничения пределов пролиферации (ограниченная линия клеток), либо трансформируется в постоянную клеточную линию. Постоянные клеточные линии быстро пролиферируют, менее чувствительны к составу ростовой среды, но утрачивают фенотип донорской ткани и стабильность кариотипа.