Приложение для самостоятельного изучения

Цитогенетические методы

Цитогенетическое исследование является первым методом изучения наследственного материала — хромосомного набора клетки, в том числе у человека. Можно отметить, что сама форма организации наследственного аппарата клетки была описана только к началу 1950-х гг., а первое описание хромосомного набора человека было сделано A. Levan, C. Ford и J. Hamerton в 1956 г. В 1958 г. была открыта хромосомная этиология болезни Дауна, что послужило толчком для развития цитогенетики, и уже в 1960 г. на конференции в Денвере была принята первая классификация хромосом человека. С этого момента можно считать появление генетических методов исследования в клинической практике.

Цитогенетическое исследование в клинике имеет своей целью оценить состояние хромосомного набора в клетках человека, установить варианты нарушений строения или количества хромосом, проследить наследование выявленных нарушений, высказаться о природе их происхождения.

Далее полученные результаты цитогенетического анализа сопоставляются с клиническим фенотипом обследованного и с учетом имеющихся научных, литературных данных формируется клинический диагноз или план дальнейших исследований.

Для классического цитогенетического исследования объектом изучения является живая клетка. Источником живых клеток может быть периферическая кровь, фибробласты кожи, клетки костного мозга, клетки амниотической жидкости и клетки ворсинчатого хориона. Получение указанных живых клеток и их выделение в каждом случае имеют свои особенности, но после получения клеток последующие основные стадии проведения исследования практически идентичны, в частности:

• получение препаратов метафазных хромосом в выделенных клетках;
• окрашивание препарата;
• микроскопический анализ и обработка результатов.

Рассмотрим проведение цитогенетического исследования на примере исследования образца цельной крови. Для получения препаратов хромосом в заранее приготовленные стерильные пробирки с гепарином в качестве антикоагулянта вносят 5–6 мл крови и закрывают стерильной пробкой. Для постановки культуры обычно используют цельную кровь, можно также использовать плазму, обогащенную лейкоцитами. В соответствующих пособиях и руководствах методы цитогенетических исследований описаны достаточно подробно, отметим лишь общую схему.

Полученную кровь (0,5 мл на 4,5 мл культуральной смеси) культивируют в термостате при температуре 37 °С. Культуральная смесь состоит из питательной среды (типа RPMI-1640, Игла или 199) с добавлением 15–17% сыворотки (крупного рогатого скота, телячьей или эмбриональной телячьей), 2 мл глутаминовой кислоты и антибактериальных препаратов широкого спектра действия (гентамицина, канамицина и т.п. в концентрации 50 кг/мл). В норме лимфоциты практически не делятся, то есть находятся в стадии G₀ клеточного цикла. Для того чтобы перевести их в стадию G₁, в культуральную смесь необходимо добавить фитогемагглютинин, стимулирующий процесс деления. Интерфазные хромосомы невозможно наблюдать в обычный световой микроскоп, а вот в митозе при делении благодаря высокой степени компактизации хромосомы становятся видимыми. Для накопления клеток на стадии метафазы митоза используют ингибиторы образования веретена деления — колхицин или колцемид^℘.

По окончании инкубации проводят фиксацию смесью метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, но перед фиксацией клетки выдерживают в гипотоническом растворе калия хлорида (0,56%); время гипотонической обработки должно составлять 20–25 мин. После нескольких смен фиксатора клеточный осадок приобретает белый цвет. При последней промывке удаляют супернатант, оставляя примерно 0,25–0,5 мл клеточной суспензии.

Одним из условий получения качественных препаратов хромосом является подготовка предметных стекол. Поверхность стекла должна быть идеально чистой. Клетки тщательно ресуспендируют в оставшемся фиксаторе с помощью пастеровской пипетки, клеточную суспензию наносят на предметное стекло и высушивают его.

Время культивирования зависит от поставленной задачи. Так, при анализе кариотипа оно составляет 72 ч. Это время соответствует наступлению второго митоза, когда число клеток удваивается. При использовании цитогенетического метода для целей биодозиметрии (об этом ниже) необходимо анализировать клетки, проходящие первое деление. В этом случае время культивирования составляет около 50 ч и варьирует в незначительных пределах для каждой лаборатории; кроме того, существуют индивидуальные колебания.

При рутинном (стандартном) окрашивании красителем Романовского–Гимза все хромосомы окрашены равномерно. В этом случае можно определить числовые мутации и такие перестройки, как дицентрики, парные и одиночные фрагменты, центрические и ацентрические кольца, хроматидные аберрации. Опытный цитогенетик может обнаружить и аномальные хромосомы, возникшие в результате инверсии или симметричной транслокации (рис. 1П).

Рис. 1П. Рутинное окрашивание хромосом

Для более детального анализа применяют дифференциальные методы окрашивания. Каждая хромосома имеет присущие лишь ей не только длину и соотношение плеч, но и уникальное чередование участков эухроматина и гетерохроматина. Благодаря этому после специальной обработки полосы (бэнды) окрашиваются в разные цвета; окраска хромосомы напоминает штрихкод. Таким образом, становится возможным выявить весь спектр хромосомных аберраций в пределах разрешения, определяемого шириной полос (рис. 2П).

Рис. 2П. Дифференциальное окрашивание хромосом (G-banding)

Во время культивирования в культуральную смесь можно добавить избыточное количество бромдезоксиуридина (аналог тимидина). Бромдезоксиуридин будет встраиваться во вновь синтезируемые цепи ДНК, и, соответственно, в каждой хромосоме клеток второго митоза в одной из хромати до бенити двунитевой молекулы ДНК будут содержать только бромдезоксиуридин вместо тимидина, а в другой — только одна из них, а другая, послужившая исходной матрицей, будет содержать тимидин. После окрашивания одна из них приобретет светлую окраску, а другая — темную (так называемые арлекиновые хромосомы). Этот метод позволяет увидеть обмены между сестринскими хроматидами.