Приложение 1
Протокол иммуногистоцитохимического метода [стандартные наборы IDetect? SUPER STAIN SYSTEM (HRP) - DAB] для клеточных мазков [все растворы, кроме фосфатно-солевого буфера таблетированного (PBS), смеси этанол-уксусная кислота и первичных антител, готовы к использованию]
1. Фиксация препарата.
1.1. Поместить препарат в 1% раствор формалина или в пары формалина (рН=7,4) на 10 мин при комнатной температуре.
1.2. Удалить остатки формалина с препарата.
1.3. Промыть препарат двумя сменами PBS по 5 мин (если проводилась фиксация в парах, достаточно одной смены).
2. Постфиксация (пермеабилизация препарата для выявления внутриклеточных антигенов).
2.1. Поместить препарат в охлажденную смесь этанола и уксусной кислоты (2:1).
2.2. Инкубировать препарат 5 мин в морозильнике (-20 °С).
2.3. Промыть препарат двумя сменами PBS по 5 мин.
3. Гашение активности эндогенной пероксидазы.
3.1. Поместить срез в 3% раствор перекиси водорода в PBS на 10-15 мин при комнатной температуре (или добавить на срез 1 каплю раствора Peroxide Block на 10-15 мин при комнатной температуре, белый колпачок).
3.2. Отмыть препарат в PBS 2 раза по 2 мин.
4. Добавление раствора Super Block для связывания неспецифической пероксидазной активности.
4.1. Осторожно удалить остатки PBS со среза.
4.2. Немедленно добавить 1 каплю Super Block (синий колпачок) на препарат.
4.3. Инкубировать срез 5 мин (но не более 10 мин) при комнатной температуре.
4.4. Отмыть препарат PBS 1 раз - 2 мин.
5. Добавление первичных антител (согласно протоколу фирмы-производителя АТ).
5.1. На срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (обычно 1:25-1:100) в PBS с 1% whole goat serum («цельная козья сыворотка») (WGS).
5.2. Инкубировать срез при 37 °С 1 ч (или в холодильнике до 18 ч) во влажной камере.