Real-time ПЦР предусматривает измерение флюоресценции после каждого термального цикла. На основе полученных данных строится флюоресцентная кривая. На этом, казалось бы, должен закончиться сложный и многоступенчатый процесс ПЦР-исследования. Однако это далеко не так: он продолжается, причем чаще всего делается это автоматически, без вмешательства сотрудника лаборатории [154]. Так, например, программа обсчета самостоятельно решает, положительная проба или нет. Стоит ли доверять этому решению? Я думаю, что не стоит. Во всяком случае это необходимо контролировать. И в данной главе я объясню свои опасения.
Последовательность получения количественного результата по окончании амплификации является непростой задачей (рис. 5.1).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 5.1. Этапы тестирования на пути получения окончательного результата. После амплификации исследователю становятся доступны исходные данные, которые в дальнейшем проходят сложную оценку. Сначала они преобразуются с целью получения Cq, а затем начинается работа с самим Cq, которая заканчивается получением количественного результата
Сначала необходимо обработать исходные данные и определить Cq (сусle of quantification), то есть тот термальный цикл, который будет пропорционален концентрации цНК. Именно этому этапу посвящена настоящая глава. На втором этапе происходит собственно вычисление концентрации цНК на основании найденного Cq. Второй этап освещен в главе 4.
В этой главе термин Cq употребляется впервые. Выше вместо него я использовал Ct, который является одной из разновидностей Cq. Однако с моей стороны это было неправильно, поскольку Ct хоть и является самым востребованным способом квантификации, но далеко не единственным.
Cq, как правило, определяется в автоматическом режиме, что опасно возникновением разного рода ошибок. Именно поэтому исследователю необходимо уметь самостоятельно давать критическую оценку первичным данным индивидуальной флюоресцентной кривой. Не обладая этими навыками, в процессе своей профессиональной деятельности, сотрудник неминуемо допустит ложноотрицательные, ложноположи-тельные результаты и неточно определит концентрацию цНК.