Цели модуля
• Знать: структуру бактериофага и его свойства; свойства генома бактерий; молекулярно-генетические методы обнаружения и идентификации микроорганизмов.
• Уметь: проводить фаго- и колицинотипирование бактериальной культуры.
• Владеть: знаниями об условиях применения молекулярно-генетических методов исследований.
4.1. БАКТЕРИОФАГИ
4.1.1. Получение фаголизатов
Принцип метода. Для получения лизата фага чувствительные бактерии заражают фагом и инкубируют, чтобы произошло размножение фага в бактериальной клетке с последующим ее лизисом. Для окончательного разрушения клеточной стенки добавляют хлороформ. Затем проводят центрифугирование. Отбирают надосадочную жидкость (фаголизат), которую хранят на холоде в закрытой резиновой пробкой пробирке или пробирке с завинчивающейся крышкой.
Методика
• 0,2 мл бульонной культуры E. coli засевают в 20 мл L-бульона (1% пептон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% раствор натрия хлорида при температуре 37 °С, 0,1% глюкоза) и аэрируют в течение 2,5 ч при температуре 37 °С до достижения концентрации 108 клеток/мл.
• Добавляют фаголизат в соотношении 1:10 и продолжают аэрацию до тех пор, пока культуральная среда не просветлеет.
• Добавляют несколько капель хлороформа, встряхивают, оставляют на несколько минут.
• Проводят центрифугирование при 3000 об./мин в течение 25 мин. Отбирают надосадочную жидкость.
4.1.2. Определение титра фага методом агаровых слоев по Грацию
Принцип метода. На поверхность плотного слоя питательного агара в чашке Петри наносят смесь фаголизата и чувствительной бактерии в полужидком агаре. Чашку инкубируют. За время инкубации каждая бактерия, присутствующая в посевном материале, образует маленькую колонию, и на поверхности агара образуется сплошной рост бактерий. Фаговые частицы, присутствующие в смеси, заражают бактерии, размножаются в них и лизируют бактериальные клетки, из которых высвобождается новое поколение фагов. Этим фаги заражают соседние бактерии. Процесс размножения фага и бактериального лизиса повторяется снова и снова, таким образом, на бактериальном газоне появляются зоны лизиса в виде бляшек. При низкой множественности заражения каждая бляшка (стерильное пятно) образуется одной фаговой частицей.