2.1. Методы идентификации S. аureus, MRSA и VISA (VRSA).
S. aureus, как и другие виды стафилококков, представляет собой грамположительные неподвижные кокки, при микроскопии располагаются в виде характерных скоплений — гроздей . Стафилококки не образуют спор, но могут образовывать капсулы . У больных муковисцидозом могут выделяться 3 морфологических типа колоний — мукоидные, не мукоидные и с SCV-фенотипом . Kahl et al . обнаружили, что более чем в 50% случаев от пациентов с муковисцидозом выделяли S. aureus с SCV-фенотипом (small colony variant (SCV) — вариант фенотипа в виде мелких колоний) [88] . Эти микроорганизмы образуют мелкие без гемолиза и пигмента медленно растущие колонии на 5% кровяном и шоколадном плотных агаризованных средах .
Идентификацию S. аureus проводят на селективной среде ЖСА . На основании фенотипических свойств — наличия пигмента и лецитиназной активности штаммы стафилококков относят к виду S. аureus . Для подтверждения принадлежности стафилококка к виду S. аureus также необходимо использовать тест на коагулазу . Летициназоположительные стафилококки, характеризующиеся положительным тестом на коагулазу, относят к виду S. аureus . Коагулазу продуцируют также S. intermedius и S. hyicus, которые редко присутствуют в клиническом материале . В некоторых случаях идентификацию стафилококков до вида можно проводить с помощью коммерческих тест систем, например, Staph 16 (Lachema) и API-Staph (bioMérieux) .
Для идентификации возможно применение также молекулярно-генетических методов (ПЦР, MLST) .
Другим важным моментом в диагностике стафилококковой инфекции является идентификация метициллинрезистентных стафилококков (MRS), среди которых особый интерес представляют MRSA . Для определения устойчивости стафилококков к метициллину обычно используют диско-диффузионный метод [17] . Применяют диски с оксациллином (1 мкг) или цефокситином (30 мкг) . Идентификацию осуществляют на среде Мюллера-Хинтона с добавлением 4% NaCl, инкубируя чашки Петри в течение 24 часов при 370 С . Некоторые исследователи предлагают проводить инкубацию в течение 48 часов при 300 С .
В связи с имеющейся гетерогенностью устойчивости к метициллину ряд исследователей рекомендуют проведение идентификации гена mecA/mecC молекулярно-генетическими методами с использованием ДНК-зондов или амплификацией гена в ПЦР . Данные методы полезны для оценки результатов определения MIC . Например, оксациллинустойчивые изоляты S. aureus с MIC между 2-8 мкг/мл могут содержать как детерминанту гена устойчивости mec, так и продуцировать высокие уровни b-лактамазы . В обоих случаях ванкомицин будет лекарством выбора, однако на b-лактамазные гиперпродуценты можно эффективно воздействовать ингибиторами b-лактамаз (клавулановая кислота, тазобактам) . Поэтому в случае отсутствия mec гена в исследуемом штамме терапевт может использовать не ванкомицин, а другой антимикробный препарат . При выявлении у стафилококков устойчивости к метициллину диско-диффузионным методом и идентификации mecA гена генетическими методами, такие штаммы рекомендуется далее тестировать на устойчивость к ванкомицину, так как большинство VISA и гетеро-VRSA обычно устойчивы к метициллину
Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) установил, что стафилококки, у которых рост ингибируется 4 и менее mg/mL ванкомицина, являются чувствительными, 8-16 mg/mL — умеренноустойчивыми и 32 и более mg/mL — резистентными . В соответствии с этими показателями в литературе умеренноустойчивые к ванкомицину штаммы S.aureus (МПК ванкомицина = 8 mg/mL) обозначают VISA, а резистентные (МПК = 32 и более mg/mL) — VRSA .
Большинство VISA изолятов первоначально выглядят в виде смешанной популяции, состоящей из различных по морфологии и пигменту колоний . Преобладают большие кремового цвета колонии и маленькие колонии серого цвета . Однако, при тестировании различных по морфологии и цвету колоний на устойчивость к ванкомицину они демонстрируют идентичные профили антибиотикограмм и ДНК при тестировании с помощью пульс-электрофореза .
Центр по контролю и предупреждению заболеваний (CDC) рекомендует 3 критерия для идентификации VISA штаммов: микроразведений в бульоне с концентрациями ванкомицина 8-16 mg/mL, Е-тест с концентрацией ванкомицина равной или более 6mg/mL и рост на коммерческом BHI (сердечно-мозговом) агаре, содержащем 6 mg/mL, в течение 24 часов при 35-37 °С . VISA не легко отличить от чувствительных штаммов с помощью быстрых автоматизированных методов, таких как Microscan панели (Dade Microscan, West Sacramento, CA, USA) или Vitek (Bimerieux) . Однако, постоянные изменения программы в Vitek (Biomerieux) могут улучшать выявление VISA [17] .